Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
434 Глава 8
t, мин
Рис. 8.1. Разделение стандартной смеси сахаров с послеколоночным
модифицированием.
Колонка: 18X0,6 см; неподвижная фаза: сяльноосновный ионообмеиник, 11±1
мкм, бо-ратная форма; элюеят: боратные буферы, 0,2-1,4 М, pH 8,6-9,5;
объемная скорость: 0,6 мл/мин; температура колонки: 40-67*0; проба: по 10
нмоль {а и б) н 50 нмоль (в) каждого компонента.
Послеколоночное модифицирование, а -реакция с бицинхонннатом меди: 0,1%-
иый раствор бнцннхоннната натрия, 0,05%-ный раствор CuS04*5H20, 0,25%
аспартамовой кислоты в 1 М растворе карбоната натрия; объемная скорость:
0,45 мл/мин; реакционная петля: 3000X0,3 мм; температура: 100 ^С;
обнаружение: при 570 нм,
б - реакция с орснном: 0,1%-ный раствор орсина в концентрированной серной
кислоте; объемная скорость: 0,65 мл/мин; реакционная петля: 2500X0,5 мм;
температура: 100 °С; обнаружение: при 420 нм.
в - реакция с перйодатом натрня: реагент I: 0,1%-ный раствор перйодата
натрия в буферной смесн 0,5 М ацетат аммоння/уксусная кислота, pH 3,8,
объемная скорость: 0,3 мл/мин; реакционная петля: 1000X0,3 мм;
температура: 100°С; реагент II: 0,75%-ный арсеннт натрня/1%-ный
ацетилацетон в буферной смесн 0,5 М ацегат натрия/уксусная кислота, pH
4,0; объемная скорость: 0,3 мл/мнн; реакционная петля: 1500X0.3 мм;
температура: Ю0вС; обнаружение; при 420 нм.
1 - 2-дезоксирибоза; 2 -сахароза; 3- глицерин; 4 - целлобиоза; 5-
мальтоза; 6 - рам-ноза; 7 - лактоза; 8 - мезоэритрнт; 9 - рибоза; 10 -
манноза; // - фруктоза; 12 - ара-бнноза; 13 - сорбит; 14 - ксилоза; /5-
^арабит; /б -глюкоза; 17 - маинит; 1S - мели-биоза; 19 - глюкуроновая, 20
- глюконовая и 21 - галактуроиовая кислоты.
ческимн аминами и фенолами с образованием окрашенных соединений, точный
состав которых не установлен. Эта особенность углеводов положена в основу
ряда аналитических методик их обнаружения и идентификации. Чаще всего
углеводы после разделения обрабатывают 0,1%-ными растворами антрона [34]
или орсина [10] в концентрированной серной кислоте. Схемы потоков в
соответствующих детекторах не имеют принципиальных отличий от схемы
потоков в бицинхонинатном детекторе. Данные о селективности реагентов
приведены в табл. 8.1 (см. также рис. 8.1).
Известно, что 1,2-диолы обладают способностью к окислительному
расщеплению связи С-С под действием перйодатов. 1,2-Диолы с терминальными
связями G-С образуют при окис-
9
t, МИН
t, мчи
(c)
0,6 мл/мин ^ (c) 0,а мл/мин
ГЕ
(c)
(c)
¦€Ъ
Рис. 8.2. Схема потоков жидкости при послеколоноч-ном модифицировании
элюата бицинхонинатом медн.
1 - элюат, поступающий нз раз-делительной колонки; 2-реагент (0,05%-ный
раствор бнцин-хонината натрия, 0,025%-ный раствор сульфата медн(П),
0,10%-ный раствор аспартамовоЙ кислоты в 1,2 Л1 водиом К2СО3); 3- мннн-
насос; 4 - манометр;
5 -Т-образное соединение (дли смешивания); 6 - реакционная петля 3000X0,3
мм, 100-130 °С;
7 - фотометр (570/420 нм); S - самописец.
Объемная скорость, мл/мин.
реагент
Воздух
Периодатный реагент
Элюат
Арсенитный реагент
Насосы
- 1 ?
Пентан-2,4-дионовыи
0,6
0,6
0.4
0,6
Баня (Z5°C)
I1 Сьрос
Колориметр
80°С'
^5мин^
15мм
LJ
Самописец
Элюат
Фотометр
"Рис. 8.3. Схема потоков жидкости в двух системах для проведения
послеколоночной обработки элюата перйодат-ацетилацетоиовым реагентом.
а - многореагентная [6] и б - упрощенная [10] системы.
Углеводы 437
лении ряд других продуктов. Формальдегид реагирует с ацетил-ацетоном с
образованием в присутствии ионов аммония желтых продуктов. К сожалению, в
присутствии избытка перйодата и образующейся йодной кислотой эти продукты
окисляются. Для обнаружения углеводов с использованием указанной реакции
был сконструирован детектор с многореагентным послеколоноч-ным реактором
(рис. 8.3, а) [18]. В работе [10] приведена схема детектора с
комбинированным двухреагентным послеколоночным реактором (рис. 8.3, б).
Поступающий из колонки элюат смешивается с раствором перйодата натрия
(0,25%) и ацетата аммония (1,5%) в 0,8 М натрий-ацетатном буфере, pH 3,2
(первый реагент). Реакция проводится в спиральном реакторе (внутр.
диаметр 0,3 мм) в течение 2,5-3 мин при 100°С. Второй реагент
представляет собой раствор арсенита натрия (0,75%) и ацетилацетона (2%) в
0,5 М натрий-ацетатном буфере, pH 4,5. Реакция со вторым реагентом
проходит в следующем реакторе того же диаметра при 100 °С в течение 1,5-
2,0 мин. Образующиеся окрашенные продукты обнаруживают фотометрически при
длине волны 420 нм. Чувствительность данного метода несколько ниже, чем
двух предыдущих.
8.4. Монодезокси- и олигосахариды
Известно, что углеводы со свободными аномерными группами образуют в
растворе в результате мутаротации равновесную смесь а- и ^-аномеров в
