Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
волн, меньших 200 нм, так как гидроксильные группы не поглощают при
больших длинах волн.
Как правило, обнаружение углеводов основано на их физических
свойствах, или же исследуемые углеводы на пред- или послеколоночной
стадии переводят в соответствующие производные, для обнаружения которых
можно воспользоваться высокочувствительными детекторами. Однако если в
первом случае (при обнаружении по физическим свойствам) в результате
разделения получаются чистые соединения, то второй подход (пред-или
послеколоночная модификация) приводит к получению производных разделяемых
углеводов, и поэтому к иему нельзя прибегать, по крайней мере в
большинстве ситуаций, в препаративных методах. Правда, можно разделить
элюат на два потока, один из которых пойдет для сбора фракций, а второй -
для их обнаружения.
8.3.1. Обнаружение по физическим свойствам
Оптическую активность углеводов можно использовать для их обнаружения
только при относительно большой концентрации углеводов, так как метод
характеризуется низкой чувствительностью [32]. Кроме того, интерпретация
хроматограмм, полученных при помощи такого метода, затруднена, так как
для них характерно перекрывание пиков. Применение УФ-детекторов для
анализа свободных сахаров и полиолов возможно лишь при длинах волн ниже
200 нм, однако в этих условиях чувствительность метода низка. Тем не
менее обнаружение кислых и ацилиро-ванных углеводов можно осуществлять
при длинах волн 200- 220 нм (область поглощения карбонильных групп,
входящих в состав карбоксильных остатков). Обнаружение бензиловых и
тритиловых эфиров, ароматических эфиров и ароматических агликоновых
производных необходимо осуществлять при длинах волн, соответствующих их
максимумам поглощения.
Наиболее широкое распространение получил рефрактометрический принцип
обнаружения углеводов, однако селективность его, а в некоторых случаях и
чувствительность бывают недостаточны.
Для обнаружения углеводов или их производных, имеющих свободную
аномерную гидроксильную группу, можно использовать электрохимические
детекторы, отличающиеся высокой чувствительностью и селективностью.
Углеводы 433.
8.3.2. Послеколоночные реакции
Для послеколоночной модификации углеводов или их производных применяются
три типа реакций, имеющих различную селективность. Эти реакции основаны
на восстановительных свойствах свободных углеводов, способности их
образовывать фур-фуролы в кислой среде и на возможности окислительного
расщепления гликолевой связи.
Рис. 8.1 позволяет сравнить селективность этих трех методов
послеколоночной модификации. В табл. 8.1 проведена оценка селективности
различных реагентов.
Углеводы и их производные со свободными аномерными гидроксильными
группами восстанавливают в щелочной среде ионы меди(П) до меди(1),
которые в свою очередь реагируют с Na-бицинхонинатом (4,4/,2,2'-
бикарбоксибихинолин) с образованием фиолетового комплекса [33]. Кроме
того, углеводы и их производные со свободными аномерными гидроксильными
группами восстанавливают [19] тетразолсульфоновую кислоту [10] до
интенсивно окрашенных формазанов. В этом случае предел обнаружения может
быть ниже 10-9 моль.
На рис. 8.2 показано направление потоков жидкости в реакционном
детекторе.
В сильнокислой среде происходит расщепление углеводов, и в результате
образуются фурфуролы и ряд соединений с меньшими молекулами, которые
реагируют с некоторыми аромати-
Таблица 8.1. Селективность некоторых реагентов для послеколоночного
модифицирования углеводов
Соединение или класс Си-бицинхо- Тетразол- Орсин/сер- Периода т-
соединений иииат сульфоновая иокнслотный иый реагент
кислота реагеит
Формальдегид + __ + "
Глнкольальдегнд + + "Г
Альдозы + + + +
Кетозы + + + +
Полиолы --- ---- --- +
Альдоновые кислоты --- --- --- +
Уооновые кислоты + + + (+)
Сахарные кислоты --- --- (+)
Сахариновые кислоты --- --- --- +
Аминосахара + + (-) ж
Фосфаты сахаров ( + ) ( + ) + (+)
Дезоксисахара + + (+) (+)
Олнгосахариды +
восста н авлива ющие + + (+)
невосстанавливаю --- --- + (+)
щие
Полисахариды --- --- + (+)
Гликозиды 1--- *--- + (+)
28-1489
