Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
о-сн2
Ьо
Фосфат о\
ео-р=с
1 /
Азотистое
основание
он
N-
VSA :jh2
Рис. 9.1. Схема однонитевого фрагмента молекулы ДНК.
ВЭЖХ основных компонентов нуклеотидов, далее обсудим возможности
разделения олиго- и полинуклеотидов, а в заключение рассмотрим роль ВЭЖХ
в синтезе олигонуклеотидов.
9.2. Методы разделения азотистых оснований, нуклеозидов и
мононуклеотидов
В настоящее время разработаны методики разделения азотистых оснований,
нуклеозидов и мононуклеотидов при помощи ВЭЖХ [1, 2]. Разделение
азотистых оснований или нуклеозидов чаще всего проводится на
катионообменных, а разделение нуклеотидов - на анионообменных смолах.
9.2.1. Ионообменники
Возможность использования ионообменников в ВЭЖХ подробно исследована
авторами работы [3]. Оптимальные условия разделения азотистых оснований
на катионообменниках указаны в
Азотистые основания, иуклеозиды и нуклеотиды 453
Рис. 9.2. Разделение смеси азотистых оснований и нуклеози-дов [5].
Колонка: 250X3 мм (внутр. диа-
метр); неподвижная фаза: аминекс А-28; элюент: 5 мМ цнтратный +
+50 мМ фосфатный буферный раствор (pH 9,25) + 55%-ный этанол;
температура: 70 °С; обнаружение:
при 260 нм.
I - 5-метилцнтознн; 2 - цнтознн; 3 - аденознн: 4 - цитиднн; 5 - ти-
мидин; 6 - тнмии; 7 - урацил; 5 - урндин; 9 -аденнн; 10 - гуаиин;
II - гнпоксантни; 12 - ксантин и гуанознн; 13 - инозин; 14 - ксанто* зин.
мин ------>
работе [4]. Разделение оснований можно также проводить на аминексе А-7
при элюировании 1 М фосфатным буферным раствором (pH 2,75) при
температуре 50°С. Если же неподвижной фазой служит аминекс А-28,
элюирование необходимо осуществлять 0,4 М фосфатно-боратным буферным
раствором (pH 8,25, 45 °С). В литературе опубликованы (в виде таблиц)
данные по зависимости заряда различных аналогов азотистых оснований от pH
раствора. Систематически изучено влияние на время удерживания на аминексе
А-28 азотистых оснований (пурина и пиримидина) и соответствующих им
нуклеозидов состава элюента на основе водно-этанольных смесей с добавками
электролита [5]. Исследованы влияние значения pH, вида и концентрации
противоиона, содержания этанола в элюенте и температуры на время
удерживания и эффективность разделения. Полученные результаты показывают,
что при изократическом элюировании все перечисленные параметры имеют
очень важное значение для оптимизации разделения оснований и нуклеозидов.
Так, при соответствующем выборе условий хроматографирования смесь,
состоящую из 14 компонентов, удалось разделить за 30 мин (рис. 9.2).
Возможности обсуждаемой системы фаз можно продемонстрировать также на
примере разделения гидролизата ДНК из тимуса теленка.
При помощи ВЭЖХ на слабых анионообменниках па основе силикагеля были
разделены самые различные смеси нуклеиновых кислот [6]. Этот метод
позволил осуществить некоторые относительно сложные анализы, например
разделить смеси 2'-, 3'-и 5'-АМФ или рибо- и дезоксирибонуклезидов и
нуклеотидов. Можно привести и другие примеры разделения, проведенного в
условиях изократического или градиентного элюирования: раз-
454 Глава 9
деление смесей моно-, ди- и трифосфатов нуклеозидов, нукле-озидов и
азотистых оснований, смеси олигонуклеотидов. Методика разделения таких
смесей сравнительно проста: хроматографирование проводится при
температуре окружающей среды и завершается достаточно быстро. В
большинстве случаев успешное разделение достигалось точным подбором
концентрации и pH буферного раствора или в результате добавления
органического модификатора. В некоторых случаях целесообразно прибегнуть
к градиентному элюированию.
Авторами работы [7] предложен экспресс-метод очистки дез-
оксирибонуклеозидтрифосфатов, имеющих радиоактивную метку, и образующихся
одновременно с ними дезоксирибонукле-озидди- и
дезоксирибонуклеозидмонофосфата и дезоксирибо-нуклеозида. Разделение
происходит в течение 3 мин (или менее) на колонке (5X0,1 см), заполненной
лихросорбом-ЫН2, при элюировании 0,025 М фосфатом калия (30 мл/ч, pH 6,8,
температура комнатная).
9.2.2. Обращенная фаза
Разделение смесей нуклеиновых кислот желательно проводить при помощи
простой разделительной системы, т. е. на одной колонке при элюировании
одним элюентом. Методом распределительной обращенно-фазовой ВЭЖХ были
разделены семь природных нуклеозидов и их оснований. Разделение и
количественное определение нуклеозидов и их оснований (в присутствии
нуклеотидов) можно осуществить в течение 30 мин, если использовать для
этого колонки, заполненные тонкодисперсной неподвижной фазой. Точность,
надежность и воспроизводимость результатов хорошие. Пики на
хроматограммах клеточных экстрактов были идентифицированы по
относительному поглощению или по методу ферментативного сдвига пика.
