Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
4.3. Трансформация колоний
Методика трансформации колоний представляет собой упрощенный вариант описанной выше сложной процедуры и основана на том наблюдении, что свежие колонии клеток можно
150
Глава 6
собрать, суспендировать в буфере для трансформации (TFB,. табл. 10) и обработать далее по описанной выше методике. При этом нет необходимости выращивать жидкую культуру Е. coli, что является ,в некоторых случаях преимуществом. Ниже приведены два варианта методики: трансформация колоний (табл. 4) и быстрая трансформация (табл. 5).
Таблица 4. Методика трансформации колоний
1. Отберите 2—4 свежие колонии1* бактерий, выращенных на чашке со средой, содержащей 10—20 мМ Mg2+. Перенесите колонии в полипропиленовую пробирку (например, Falcon 2059). с 200 мкл TFB и энергично суспендируйте на встряхивателе. Отбирая колонии при помощи вольфрамовой петли, старайтесь собрать максимальное количество бактериальной массы и в-то же время не захватить кусочков агара.
2. Проинкубируйте пробирку 15—30 мин во льду.
3. Внесите 1 мкл раствора ДМСО и ДТТ (ДиД)2) в центр раствора и размешайте, несколько секунд вращая пробирку между ладонями. Проинкубируйте во льду 10—15 мин.
4. Добавьте еще 7 мкл ДиД, размешайте и проинкубируйте во льду 10—20 мин.
5. Добавьте раствор ДНК в объеме менее 20 мкл. Проинкубируйте во' льду 10—40 мин.
6. Поместите раствор на 90 с в водяную баню с температурой 42 “С! (тепловой шок), затем охладите 2 мин во льду.
7. Добавьте 800 мкл среды SOC3>. Проинкубируйте4» при 37 °С и умеренном встряхивании 30—60 мин. Высейте бактерии на подходящую селективную среду.
Вариант
ДМСО и ДТТ можно добавлять по отдельности, как указано в табл. 3.. Раствор ДМСО+ДТТ можно добавлять и одной порцией в 14 мкл.
]) Диаметр колоний должен составлять 2—4 мм. Колонии лучше собирать при комнатной температуре. Можно, вынув чашку из термостата, выдержать ее >1/2 часа пряв 20 °С либо после инкубации при 37 °С инкубировать до 3 дней при 20 X. После того» как колонии суспендированы, среда должна заметно помутнеть. Если этого не произошло, для получения плотной суспензии добавьте еще несколько колоний.
2) См. табл. 10.
3) См. табл. 12.
4) При трансфекции М13 эта стадия не нужна.
5) См. примечание 3 к табл. 2.
Таблица 5. Быстрая трансформация
1. С помощью вольфрамовой петли отберите с чашки несколько колоний (или комочек клеток), стараясь не захватывать кусочки агара.
2. Энергично диспергируйте колонии (либо на встряхивателе, либо многократно набирая суспензию клеток в пипетку) в 200 мкл стандартного буфера для трансформации (TFB1*).
3. Проинкубируйте 10 мин во льду.
4. Добавьте ДНК (10—200 нг) в объеме <20 мкл, размешайте и проинкубируйте 10 мин во льду.
5. Прогрейте клетки 90 с при 37—42°С (тепловой шок).
6. Засейте подходящую селективную среду несколькими фракциями (например, 1, 5 и 25%) реакционной смеси.
’) См. табл. 10.
Методы трансформации Е. coli
151
Эффективность приведенной в табл. 4 методики трансформации колоний составляет от 1 -107 до 2-108 колоний на мкг ДНК pBR. Для нее необходима лишь чашка с относительно свежими клетками. Эта методика удобна для субклонирования и конструирования плазмид. Клетки можно посеять на богатой среде, содержащей 10—20 мМ Mg2+, вырастить колонии в течение ночи при 37 °С и инкубировать их далее при комнатной температуре до начала эксперимента (до 2 сут). Для получения надежной трансформации необходимо выполнить два главных условия. Диаметр колоний должен составлять 3—5 мм. Для каждой реакции трансформации (объем смеси 200 мкл) необходимо 2—4 колонии (в зависимости от размера). Кроме того, при отборе колоний важно не захватывать вместе с бактериями частицы агара, так как агар мешает трансформации. Удобно использовать вольфрамовую петлю, например петлю Йоргенсона (фирма Scientific Products) или эквивалентную. Хорошие результаты получаются тогда, когда удается собрать достаточную массу бактерий, не загрязнив их кусочками агара. Основной недостаток данного метода получения компетентных клеток состоит в том, что уровень насыщения клеток в этом случае оказывается ниже, чем сходной популяции, полученной из жидкой культуры. Другими словами, доля компетентных клеток в такой популяции ниже, чем в популяции, полученной из жидкой культуры, хотя частота трансформации в этих случаях сравнима. Метод трансформации колоний нецелесообразно применять в тех случаях, когда стоит задача получить максимальное число колоний из данного количества ДНК, например при клонировании кДНК или «спасении» интегрированных плазмид.
Приведенная в табл. 5 процедура быстрой трансформации представляет собой упрощенную методику трансформации колоний. Клетки диспергируют в TFB, добавляют ДНК и рассе-вают (иногда даже без теплового шока). Это очень быстрая, но малоэффективная методика (~ 103—104 колоний/мкг). Ее используют для быстрого введения уже клонированных плазмид в Е. coli. Вместо того чтобы хранить в замороженном виде или на столбиках агара клетки Е. coli, несущие плазмиды, эти плазмиды можно сохранить в форме ДНК- Если какая-либо из плазмид необходима для работы, ее можно быстро ввести в Е. coli и размножить. При этом нет необходимости хранить и пересевать большое число трансформированных штаммов, а плазмиды не могут потеряться в результате гибели или загрязнения клеток. Кроме того, при этом достигается экономия места. Если в лаборатории имеются сотни рекомбинантных плазмид, их хранение в форме бактериальных культур становится тяжелой задачей. По опыту автора, длительное хранение плазмид в виде ДНК удобно и надежно. В заморожен-
