Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
КС1 (особо чистый) 7,4 г 100 мМ
МпС12-4Н20 8,9 г 45 мМ
СаС1а-2Н20 1,5 г 10 мМ
НАСоС13') 0,8 г 3 мМ
K-MES 20 мл 0,5 М запасного 10 мМ
раствора (pH 6,3)
pH рабочего раствора
6,20± 0,10
Приготовление: 0,5 М раствор MES (2 [N-морфолнно] этансульфоновой кислоты) оттитруйте до pH 6,3 концентрированным КОН, простерилизуйте фильтрованием через мембрану с порами 0,22 мкм и храните в аликвотах при —20 °С. 10 мМ раствор К-MES приготовьте из запасного раствора, используя воду максимально возможной чистоты. Добавьте соли (в сухом виде) и профильтруйте раствор через предварительно промытую мембрану с порами
0,22 мкм. Разлейте по стерильным флаконам и храните при 4°С (TFB храт нится более года).
Б. Буфер для замораживания клеток (FSB)
Компонент
Количество в литре
Конечная концентрация
КС1
МпС12-4Н20
СаС12-2Н20
НАСоС13»
Ацетат калия
Перегнанный глицерин pH рабочего раствора 6,20 ±0,10
7.4 г
8,9 г
1.5 г
0,8 г
10 мл 1 М запасного раствора (pH 7,5)
100 г
100 мМ 45 мМ 10 мМ
3 мМ 10 мМ
10% (вес/объем)
Приготовление: оттитруйте 1 М раствор ацетата калия до pH 7,5 КОН, простерилизуйте через мембрану с порами 0,22 мкм и храните в замороженном состоянии. Используя этот раствор, приготовьте 10 мМ раствор ацетата калия с 10% глицерина на максимально чистой воде. Добавьте сол» (в сухом виде), доведите (при необходимости) до pH 6,4 0,1 N НС1. Повышать pH при помощи основания не следует. (pH будет изменяться в течение 1—2 дней н установится равным 6,1—6,2.) Простерилизуйте раствор фильтрованием через промытую мембрану с порами 0,22 мкм и храните при 4°С.
В. Простой буфер для трансформации (SB)
Компонент
Количество в лнтре
Продолжение
Конечная концентрация
SB
КС1
€аС12-2Н20
X-MES
pH 6,2 SB2 КС1
МпС12-4Н20
*СаС12-2Н20
K-MES
pH 6,2
7.4 г 100 мМ
7.5 г 50 мМ
20 мл 0,5 М запасного 10 мМ раствора (pH 6,3)
7.4 г 100 мМ
8,9 г 45 мМ
1.5 г 10 мМ
20 мл 0,5 М запасного 10 мМ раствора (pH 6,3)
Т. Простой буфер для замораживания клеток (FB)
Компонент
Количество в литре
Конечная концентрация
КС1
•€аС12-2Н20 Перегнанный глицерин Ацетат калия
pH 6,2
7.4 г
7.5 г 100 г
10 мл 1 М запасного раствора (pH 7,5)
100 мМ 50 мМ
10% (вес/объем) 10 мМ
Приготовление SB и FB: к 10 мМ буферному компоненту, приготовленному на максимально чистой воде так, как указано выше, добавьте СаС12. Буфер не обязателен, но улучшает надежность и воспроизводимость трансформации. pH рабочего раствора должен быть 6,2. Вместо ацетата калия для FB можно использовать 10 мМ MOPS pH 6,5.
Д. Буфер трансформации % 1776 (XFB)
Компонент
Количество в литре
Конечная концентрация
RbCl
МпС12-4Н20 Ацетат калия
СаС12-2Н20
MgCl2-6H20
1ЛС1
Сахароза (особо чистая) pH 5,80
12 г
8,9 г
35 мл 1 М запасного раствора (pH 7,5)
1,5 г 1,0 г 20 мг 150 г
100 мМ 45 мМ 35 мМ
10 мМ 5 мМ 0,5 мМ
15% (вес/объем)
Продолжение-
Приготовление: все компоненты, кроме МпС12 и RbCI, растворите в воде максимальной чистоты. Оттитруйте до pH 5,92. Добавьте МпС12 и RbCI1 в сухом виде, после чего pH должен понизиться до 5,80 ±0,02. Лучше избегать последующего подведения pH. Профильтруйте через промытую* мембрану с порами 0,22 мкм и храните при —20 °С.
Е. RFJ
Компонент
Количество в литре
Конечная концентрация
RbCI
МпС12-4Н20 Ацетат калия
СаС12-2Н20 Глицерин 150 г
(pH 5,80)
pH доведите 0,2 М уксусной мембрану с порами 0,22 мкм.
12 г
9,9 г
30 мл 1 М запасного раствора (pH 7,5)
1,5 г
100 мМ 50 мМ 30 мМ
10 мМ
15% (вес/объем)
кислотой. Простерилизуйте через промытую
Ж. RF2
Компонент
Количество в лнтре
Конечная концентрация
MOPS 20 мл 0,5 М запасного 10 мМ
раствора (pH 6,8)
RbCI 1,2 г 10 мМ
СаС12-2Н20 11 г 75 мМ
Глицерин 150 г 15% (вес/объем)
pH — 6,8
pH доведите NaOH н простерилизуйте фильтрованием через промытую мембрану с порами 0,22 мкм.
3. Раствор ДМСО и ДТТ (ДиД)
Компонент
Количество в конечном объеме 10 мл
Конечная концентрация
ДТТ 1,53 г 1 М
