Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Литература
1. Messing J. Methods Enzyme!., 101, 20 (1983).
2. Novander J., Kempe Т., Messing J. Gene, 26, 101 (1983).
3. Dotto G. P., Enea V., Zinder H. D. Virology, 114, 463 (1981).
4 Dotto G P., Horiuchi K. J. Mol. Biol., 153, 169 (1981).
5. Dente L., Cesareni G„ Cortese R. Nucleic Acids Res., 11, 1645 (1983).
6 Hinnen A., Hicks J. B., Fink J. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929
(1978).
7 Struhl K, Stinchcomb D. Т., Scherer S., Davis R. W. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 76, 1035 (1979). ^ J
8 Stinchcomb D Т., Thomas М., Kelly J., Selker E„ Davis R. Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 77, 4559 (1980).
9 Remaut H. Stanssens P., Fiers W. Nucleic Acids Res., 11, 4677 (1983).
10' Queen С. X Mol. Appl. Genet., 2, 1—10 (1983).
11. Rose M. Ph. D. thesis, M.I.T., 1982.
12. Tschumper G„ Carlson I. Gene, 10, 157 (1980).
13 Hartley L L„ Donelson I. E. Nature, 286, 157 (1980).
ГЛАВА 6
МЕТОДЫ ТРАНСФОРМАЦИИ Е. COLI
Дуглас Ханаан
1. Введение
Методы введения плазмид в клетки Е. coli — неотъемлемая часть методического арсенала молекулярной биологии. Трансформация Е. coli плазмидами была впервые продемонстрирована Коэном с соавт. [1] вскоре после того, как Манд ель и Хига [2] показали, что совместная инкубация Е. coli и бактериофага К при О °С в присутствии СаСЬ приводит к инфекции (в действительности— к трансфекции). С этого момента феномену трансформации клеток плазмидами посвящалось значительное число исследований, целью которых являлось как повышение эффективности трансформации, так и изучение влияющих на нее факторов [3—15].
Эти исследования привели к представлению о том, что клетки Е. coli и чужеродная ДНК продуктивно взаимодействуют при низких температурах в среде, содержащей двухвалентные катионы. Частоту трансформации можно повысить различными способами: подвергая смесь клеток и ДНК тепловому шоку; вводя в эту смесь моновалентные катионы; добавляя хлорид гекс-аминокобальта(Ш); обрабатывая клетки растворителями и сульфгидрильными реагентами; выращивая клетки в среде с повышенным, содержанием магния (10—20 мМ). Такие обработки повышают частоту трансформации с 1/105 до более чем 1/102 (т. е. одна из 100 внесенных молекул плазмиды трансформирует клетку).
В этой главе описан ряд методик плазмидной трансформации, начиная с классической кальциевой (простой, но малоэффективной) до сложной, высокоэффективной, дающей необходимую для клонирования высокую частоту трансформации. В табл. 1 приведена сводка различных методик, подробно описанных ниже.
2. Выбор штамма
Выбор конкретного штамма Е. coli диктуется целью эксперимента и в ряде случаев применяемой методикой трансформации. Можно дать несколько общих рекомендаций. Штамм Е. coli С600 [16] и его производные хорошо растут и эффективно трансформируются всеми описанными здесь методами. Штамм
\
\
-—-
Методы трансформации Е. coli
141
Таблица 1. Методики трансформации
Табли Методика Средняя ча Применимость Примечание
ца стота транс
формации1)
Простая транс- 105—107 формация
Стандартная 2—7-10е
трансформация
Трансформация 0,5—2-I08 колоний
Быстрая транс- Ю3—104 формация
С заморажива- Ю5—107 нием клеток I
С заморажива- 107—108 нием клеток II
С заморажива- 107—108 нием клеток III Для трансфор- Ю8 мации %П7Ъ
МС10612), С6003>,
DH14>, большая часть производных К12
DH1, С600, JM 1095), многие производные К12
DH1, С600, JM 109, многие производные К12
Большинство производных К12
MCI 061, С600
DH1, большинство производных К12
DH1, C600, JM109, большинство производных К12
DH1, С600, НВ101,
JM109
Х17766
Вариант оригинальной методики [2]. Проста, но малоэффективна
Наивысшая частота трансформации и наивысшая доля компетентных клеток. Чувствительна к загрязнению НгО и диме-тилсульфоксида (ДМСО)
Быстрая и удобная методика, хороша для большинства целей (не требует жидкой культуры)
Очень быстрая и малоэффективная методика, полезна для ретрансформации клонированных плазмид Удобна, но малоэффективна
Удобна и эффективна. Чувствительна к загрязнениям НгО и ДМСО
Удобна и эффективна. Не требует ДМСО Рекомендуется только для экспериментов в условиях EK.II и для трансформации мутантов по клеточной стенке
1) частота трансформации выражена в числе колоний, образующихся в расчете на
1 МК2) ^енотнп^Е^соЯ МС1061: F-, araD139, А(ага, 1еи)7б96, Mac Y74, galU-, galKr, hsr-,
/ism+ s^M.o^Hn ^ ^ C600: ^ supE44' ieUQg' lacYl, tonA21, X-.
<) Генотип E. coli DH1: F~, endAl, hsdR17(rk-, mfe+), supE44, thi-1, recAl,
gyrA96, E col. jM!09; recAl, endAl, gyrASS, thi, hsdR17, supE44, relAl,
Шас-proA В), F', iraD36, proA,B, lacIqZ-M15.
^Генотип E. coli Y1776: F-, tonA53, dapDS, minAl, gluU44, (supE42), Mgal-uvrB)40,
