Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
282
Глава 2
дели, оптимальной может быть 3—5-дневная инкубация на неселективной среде перед добавлением антибиотика. Если внести антибиотик слишком рано, трансформированные протопласты погибнут, поскольку не успеют в полной мере экспрессировать устойчивый фенотип. Если же антибиотик добавить поздно, обрывки мицелия, которые случайно сохранились в суспензии протопластов (только очень хорошие препараты не содержат мицелия), успеют прорасти и подавить рост протопластов, поскольку последние растут гораздо медленнее.
Таким образом, существует довольно узкое «окно» для оптимального внесения антибиотика, и этот временной интервал надо определить эмпирически для каждого конкретного штамма. Очень приблизительно можно считать, что момент для добавления антибиотика настал, едва регенерирующие протопласты становятся видимыми на чашке — поверхность агара при этом как бы затуманивается.
5. Среды
Среды, упоминающиеся в методиках, описанных в данной главе, приведены ниже.
Раствор для обработки лизоцимом (на 500 мл):
50 г сахарозы
2,86 г TES (N-трис- (оксиметил) метил-2-аминоэтансульфоно-вая кислота)
0,217 г сульфата калия (2,5 мМ)
0,253 г хлорида магния (2,5 мМ, MgCl2-6H20)
0,183 г хлорида кальция (2,5 мМ, СаС12-2Н20)
1 мл раствора микроэлементов
pH раствора устанавливают 7,2, прежде чем довести водой его объем до окончательного. Разливают раствор по 100 мл во флаконы и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин. Перед
использованием к каждой порции (100 мл) добавляют 0,5 мл
1%-ного раствора КН2Р04.
Среда Р (на 1 литр):
5,73 г TES 103 г сахарозы 2,03 г MgCl2-6H20 0,5 г K2S04 3,68 г СаС12-2Н20
2 мл раствора микроэлементов
Добавляя NaOH, доведите pH среды до 7,4. Автоклавировать 15 мин при 121 °С. Непосредственно перед использованием внесите 1 мл 1% КН2Р04/100 мл.
Клонирование генов в стрептомицетах
283
Агар R2
Состоит из двух компонентов, каждый из которых готовится отдельно.
R2/A (на 1 литр):
0,5 г K2SO4
20,2 г MgCl2-6H20
5.9 г СаС12-2Н20 20 г глюкозы
6 г пролина
0,2 г казаминокислот
4 мл раствора микроэлементов
Разлейте порциями по 100 или 200 мл; помните, что полная среда будет иметь вдвое больший объем. Добавьте агар из расчета 4,4 г на 100 мл раствора. Автоклавируйте 15 мин при 121 °С.
R2/B (на 1 литр):
11.5 г TES. Доведите pH до 7,4, добавляя NaOH 10 г дрожжевого экстракта
203 г сахарозы
Разлейте порциями по 100 или 200 мл. Автоклавируйте 15 мин при 121 °С. Перед заливкой чашек объедините R2/B и R2/A и добавьте по I мл 1%-ного раствора КН2Р04 на каждые 200 мл полной среды.
Раствор микроэлементов (на 1 л)
40 мг ZnCl2
200 мг FeCl3-6H20
10 мг СиС12-2Н20
10 мг МпС12-4Н20
10 мг Na2B407- ЮН20
10 мг (NH4)6Mo7024-4H20
Среда для трансформации — «Т-смесь» (на 500 мл):
12.5 г сахарозы
7,35 г хлорида кальция (СаС12-2Н20 : 100 мМ)
0,218 г сульфата калия (2,5 мМ)
1 мл раствора микроэлементов
2.9 г малеиновой кислоты
Доведите pH до 8,0, добавляя 1М трисосновной и автоклавируйте при 121 °С 15 мин.
Streptomyces — YEME (на 1 л):
3 г дрожжевого экстракта
5 г пептона
3 г экстракта солода
284
Глава 2
10 г глюкозы 340 г сахарозы 1,15 г MgCl2-7H20 Автоклавировать 15 мин при 121 °С.
Streptomyces — TSB (на 1 л)
30 г TSB (Sigma)
Автоклавировать 15 мин при 121 °С.
Литература
1. Bibb М. Schott el I. L„ Cohen S. N. Nature, 284, 526 (1980).
2. Hopwood D. A., Chater K. F., Dowding J. E„ Vivian A. Bacteriol. Rev., 37,
371 (1973).
3. Hopwood D. A., Wright H. M. J. Gen. Microbiol., 129, 3575 (1983).
4. Berdy J. Process Biochem., 28, 1980.
5. Fietelson J. S., Hopwood D. A. Mol. Gen. Genet., 190, 394 (1983).
6. Gil J. A., Hopwood D. A. Gene, 25, 119 (1983).
7. Malpartida F., Hopwood D. A. Nature, 309, 462 (1984).
8. Bibb M. J., Ward J. M„ Kieser TCohen S. N., Hopwood D. A. Mol. Gen, Genet., 184, 223 (1981).
9. Delic V., Hopwood D. A., Friend E. J. Mutat. Res., 9, 167 (1970).
10. Hunter I. S., Friend E. J. Biochem. Soc. Trans., 12, 643 (1984).
11. Williams S. T„ Goodfellow М., Alderson G., Wellington E. М. H.,
Sneath P. H. A., Sachin M. J. J. Gen. Microbiol., 129, 1743 (1983).
12. Kieser Т., Hopwood D. A., Wright H. М., Thompson C. J. Mol. Gen. Genet., 185, 223 (1982).
13. Katz E., Thompson C. J., Hopwood D. A. J. Gen. Microbiol., 129, 2703 (1983).
14. Richardson M. A., Mabe J. A., Beerman N. E., Nakatsukusa W. М., Fayer-man J. T. Gene, 20, 451 (1982).
15. Manis J. J., Highlander S. K. Gene, 18, 13 (1982).
16. Thompson C. J., Ward J. M„ Hopwood D. A. Nature, 286, 525 (1980).
17. Bibb M. J., Ward J. М., Kieser Т., Cohen S. N., Hopwood D. A. Mol Gen. Genet., 184, 230 (1981).
18. Thompson C. J., Kieser Т., Ward I. M„ Hopwood D. A. Gene, 20, 51 (1982).
