Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
маркера TRPI+ и сохраняется у 90% кле-URA3+, а также ток. Удобен для клони-хромосомный учас- рования генов, присутст-ток ars и центро- вие которых в клетке мерную зону хро- более чем в одной ко-мосомы IV пии может оказаться
летальным
Автономный низ- YLP21 [32]
кокопийный-мини-
хромосомный
Экспрессирующий
нерегулируемый
рААН5 [33]
Линейная плазми- Низкокопийный вектор; да на основе относительно стабилен. YLpl; содержит Удобен для изучения по-добавочные по- следовательностей суще-следовательности ственных для реализации фага Я и центро- хромосомных функций мерную зону хромосомы III дрожжей
Кольцевая плазми- Удобен для осуществле-да; содержит про- ния гиперэкспрессии ген-мотор алкоголь- ных продуктов в дрож-дегидрогеназы с жевых клетках удобными сайтами для клонирования
Экспрессирующий
регулируемый
YEp51 [29] pYE4 [34]
Удобен для осуществления регулируемой экспрессии генного продукта, гиперэкспрессия которого может оказаться вредной для клетки, а также для временного контроля экспресии интересующего продукта
Экспрессирующий-
секретирующий
Кольцевая плазмида; содержит регулируемые промоторы (галакто-зо- и фосфат-за-висимые), экспрессию которых можно контролировать путем изменения концентрации экзогенного субстрата или используя генетические локусы, существенные для экспрессии
рАВ 112 [35] Кольцевая плазми- Последовательностью
да; содержит сиг- a-фактора обеспечивает нальную последо- секрецию малых белков вательность про- в виде составных процессинга гена а- дуктов, одной из частей фактора (MFal) которых является сигнальный участок MFal
296
Глава 3
Таблица 3. Трансформация сферопластов
1. Нарастите культуру дрожжевых клеток до титра 1—3-107/мл в 50 мл жидкой среды YPD‘>.
2. Промойте клетки дважды в 10 мл 1М сорбитола (Aldrich) путем повторения цикла: осаждение в настольной центрифуге — ресуспендирование осадка.
3. Ресуспендируйте клетки в 5 мл 1М сорбитола и добавьте 5 мкл Р-меркаптоэтанола.
4. Приготовьте разведение суспензии 10-5 (в воде) и высейте 100 мкл на твердую среду YPD. Эта чашка будет служить контролем при подсчете доли погибших клеток в процессе приготовления сферопластов.
5. Добавьте 150 мкл глузулазы (Endo Laboratories Inc.) и инкубируйте при 30 °С при мягком покачивании в течение примерно 30 мин. Определите оптимальное время обработки глузулазой данного штамма путем изменения ¦продолжительности инкубирования и подбора такого временного интервала, при котором 99% клеток превращаются в сферопласты и 10—20% их сохраняют способность к регенерации.
6. Приготовьте разведение 10_3 (в воде) и высейте 100 мкл на среду YPD, чтобы оценить долю выживших клеток.
7. Осадите сферопласты путем центрифугирования суспензии при 2500 об/мин2) в течение 7 мин и мягко ресуспендируйте в 2 мл 1 М сорбитола. Доведите объем до 10 мл 1 М сорбитолом и снова осадите клетки центрифугированием. Повторите процедуру еще раз.
8. Еще раз ресуспендируйте сферопласты в 2 мл Г М сорбитола. Доведите объем суспензии до 9 мл 1 М сорбитолом и добавьте 1 мл раствора:
0,1 М трис-НС1 pH 7,4; 0,1 М СаС1г. Осадите сферопласты и ресуспендируйте осадок в 1,6 мл 1М сорбитола, содержащего 10 мМ СаС12.
9. Разделите клетки на порции по 0,2 мл. Для трансформации к каждой такой порции добавляйте ДНК (1—10 мкг) в объеме, не превышающем
20 мкл.
10. Инкубируйте клетки с ДНК при комнатной температуре в течение 10 мин. Тщательно суспендируйте клетки и добавьте 2 мл 50% (по весу) PEG 4000, смешанного с 0,2 мл раствора: 0,1 М трис-НС1 pH 7,4; 0,1 М СаС12.
11. После 10 мин инкубации при комнатной температуре осадите сферопласты путем центрифугирования (см. стадию 7), затем ресуспендируйте клетки в 0,5 мл 1 М сорбитола, содержащего 10 мМ трис-НС1 pH 7,4 и 10 мМ СаС12, высейте в 10 мл регенерационного агара3' при температуре 45—50 °С на подходящую минус-среду.
]) Рецептура среды YPD приведена в табл. 5.
2) Клетки или сферопласты осаждают, используя ротор 215 для клинической центрифуги IEC. Допустимы любые эквивалентные замены.
3) Рецептура приведена в табл. 5.
разд. 4.1). Не менее важно и то, что в некоторых случаях гораздо удобнее собирать клетки с поверхности чашки, чем из толщи регенерационного агара.
Не так давно мы провели трансформацию клеток следующим образом: ресуспендировали свежую (двухдневную) колонию с YPD-чашки в 1,0 М LiCl, инкубировали клетки в течение 4—8 ч и затем обрабатывали их по методике, описанной в табл. 4, начиная с этапа 4. Эффективность трансформации для линейных молекул варьировала от 10 до 100 трансформан-тов/мкг/107 клеток.
Клонирование в дрожжах
297
Таблица 4. Трансформация «литиевых» клеток
1. Нарастите культуру дрожжевых клеток в 100 мл среды YPD1) до ОП6оо=0,4 (примерно 1-—2-107 клеток/мл).
2. Центрифугируйте клетки при 2500 об/мин в течение 7 мин в настольной центрифуге. Ресуспендируйте клетки в ТЕ2> и снова осадите центрифугированием.
