Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 5. Экстракция суммарной ДНК стрептомицетов из мицелия разрушенного с помощью стеклянных шариков (метод III) ,
1. Внесите в 200 мл среды TSB или YEME (в зависимости от штамма — см. текст) 1 мл концентрированной суспензии спор. Инкубируйте на качалке при 30 °С.
2. Осадите клетки, когда культура достигнет заметной плотности (обычно для этого требуются 2 дня) путем центрифугирования в 250 мл стакане в роторе Beckman JA14 (или эквивалентном) при 12 000 об/мин (22 100 g) в течение 10 мин.
3. Ресуспендируйте осадок в 0,3 М сахарозе и центрифугируйте как описано в п. 2.
4. Поместите 2 г мелких стеклянных шариков (100 меш) в ступку и заполните ее жидким азотом. Шпателем снимите осадок мицелия со стенок центрифужного стакана и поместите его в ступку. Растирайте смесь пестиком, добавляя по мере надобности жидкий азот, чтобы смесь оставалась замерзшей.
5. Продолжайте растирать до тех пор, пока не получится тонкая пудра. Шпателем всыпьте эту пудру в 10 мл буфера SNET1* и центрифугируйте в роторе Beckman JA20 (или эквивалентном) при 10 000 об/мин (12 100 g),
4 °С в течение 20 мин.
6. Соберите надосадочную жидкость и измерьте ее объем. Добавьте РНКазу до конечной концентрации 100 мкг/мл и инкубируйте при 50 °С 30 мин. Добавьте протеиназу К до конечной концентрации 50 мкг/мл и инкубируйте при 37 °С в течение 30 мин.
7. Добавьте равный объем фенола, насыщенного ТЕ. Нерезко переверните пробирку и верните в исходное положение. Повторяйте эту процедуру при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифугируйте, отберите водную фазу, добавьте равный объем хлороформа и нерезко переворачивайте пробирку при комнатной температуре в течение 10 мин.
8. Центрифугируйте, отберите водную фазу и измерьте ее объем. Добавьте CsCl из расчета 1 г на 1 мл жидкости и аккуратно перемешайте, чтобы соль полностью растворилась. Перенесите раствор в центрифужную пробирку и заполните ее либо раствором CsCl (20 г CsCl+20 мл ТЕ), либо минеральным маслом. Плотность раствора должна быть приблизительно
1,72 г/мл.
(Примечание: этот раствор не содержит этидиумбромида.)
9. Проведите равновесное центрифугирование в роторе VTi50 (40 000 об/мин, 16 ч, 20 °С).
10. Срежьте верхушку пробирки нагретым скальпелем или лезвием бритвы. Используя 100 мкл капилляр, соединенный с тефлоновым микрошлангом, раскапайте содержимое пробирки на фракции по 1 мл в пробирки для микроцентрифуги.
11. Определите, какие фракции содержат ДНК. Для этого нанесите по
5 мкл раствора из каждой фракции на пластину 1%-ной агарозы, содержащей 1 мкг/мл этидиумбромида.
12. Диализуйте фракции, содержащие ДНК, против 100 объемов буфера ТЕ; сделайте две смены буфера. Добавьте 0,1 объема 5 М NaCl и 2,2 объема этанола. Перемешайте и охладите до — 20 °С. Осадите ДНК центрифугированием, удалите надосадочную жидкость, а осадок подсушите на воздухе.
13. Растворите осадок в ТЕ и определите концентрацию ДНК и чистоту препарата, сняв спектр поглощения в интервале длин волн 230—280 нм.
>) SNET: 2% саркозила; 50 мМ ЭДТА; 50 мМ NaCl; 50 мМ трис-НС1 pH 7,6.
Таблица 6. Выделение ковалентно замкнутой кольцевой ДНК из стрептомицетов
1. ^несите в 200 мл среды TSB или YEME (в зависимости от штамма — см. текст), содержащей антибиотик для селекции клеток с плазмидами, 1 мл концентрированной суспензии спор. Инкубируйте на качалке при 30 °С.
2. Осадите клетки, когда культура достигнет заметной платности (обычно для этого требуются 2 дня), путем центрифугирования в 250 мл стакане в роторе Beckman JA14 (или эквивалентном) при 12 ООО об/мин (22 100 g) в течение 10 мин. Культуры, выращенные в среде YEME, перед центрифугированием рекомендуется разбавить вдвое стерильной водой.
3. Ресуспендируйте осадок в 25 мл буфера ТЕ. Добавьте 5 мл 0,25 М ЭДТА и 75 мг лизоцима. Инкубируйте при 30 °С в течение 20 мин.
4. Добавьте 25 мл ТЕ; 15 мл 0,25 М ЭДТА и 4,2 мл 20%-ного SDS. Немедленно перемешайте (нерезко) стеклянной палочкой. Клетки лизируют-ся, и раствор становится вязким. Добавьте 16,8 мл 5 М. NaCl и аккуратно перемешайте стеклянной палочкой. Инкубируйте при 4°С в течение 4 ч.
5. Центрифугируйте смесь в роторе Beckman JA14 (или эквивалентном) при 14 000 об/мин (31 000 g) 4 °С в течение 30 мин. Если при этом не сформировался плотный осадок, центрифугируйте в том же режиме еще раз. Отберите надосадочную жидкость в стерильный мерный цилиндр. Добавьте 0,5 объема стерильного 30%-ного раствора PEG 6000, перемешайте, закрыв и перевернув цилиндр, перелейте содержимое в 250 мл центрифужный стакан и оставьте при 4 °С на ночь.
6. Центрифугируйте при 5000 об/мин (3840 g), 4°С в течение 5 мин. Осторожно удалите надосадочную жидкость.
7. Ресуспендируйте осадок в 13 мл ТЕ. Добавьте 13 г CsCl и мягко перемешайте, чтобы вся соль растворилась. Добавьте 500 мкл этидиумбро-мида (10 мг/мл в ТЕ). Плотность раствора должна составлять 1,58 г/мл.
