Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
1. Выделяют хромосомную ДНК из клеток донора (см. разд. 4.2.1) и проводят ее частичный гидролиз какой-нибудь мелко-щепящей рестриктазой, например Sau3A. Фракционируют гидролизат так, чтобы средняя длина предназначенных для клонирования фрагментов ДНК укладывалась в заранее определенные пределы. Этот этап важен при клонировании в лямб-доидных и космидных векторах и может оказаться весьма полезным в плане статистического анализа обычных плазмидных библиотек генов. Этот подход обсуждался в гл. 1.
266
Глава 2
I.Донор
Л. Вектор
Выделение хромосомной ДНК
Выделение вентерной ЛНК
Обработка
рестриктазой
Обработка
рестриктазой
Фракционирование по размеру (необязательно)
Обработка фосфатазой (необязательно-)
Ш.Лигирэвание
Осаждение ДНК, растворение осадка в ТЕ
Н.Реципиент
^.Трансформация ЭД.Регенерация
Получение протопластов
Селенция клонов
Рис. 6. Получение банка клонов геномной ДНК Streptomyces.
2. Выделяют ДНК-вектор (см. разд. 4.2.2), обрабатывают ее рестрикционной эндонуклеазой, которая дает «липкие концы», совместимые с липкими концами, присутствующими в хромосомной ДНК- Затем обрабатывают фосфатазой для того, чтобы предотвратить циклизацию вектора без вставок в процессе лигирования (см. разд. 4.2.4).
3. Проводят реакцию лигирования вектора и фрагментов донорной ДНК (см. разд. 4.3).
Эти три стадии — общие для процедур получения любого геномного банка. Однако в случае стрептомицетов ДНК вводится не в нативные реципиентные клетки, а в протопласты, и этот этап сильно отличается от трансформации Е. coli.
4. Обрабатывают клетки лизоцимом для удаления клеточной стенки; протопласты сохраняют в среде с подходящими осмотическими свойствами (см. разд. 4.4).
5. Смешивают ДНК с протопластами и добавляют полиэти-ленгликоль (PEG). Пока еще малопонятным образом ДНК проникает внутрь клеток, т. е. они трансформируются (см. разд. 4.5).
6. Регенерируют протопласты (трансформированные и не-трансформированные) на богатой среде в неселективных уело-
Клонирование генов в стрептомицетах
267
виях (т. е. стимулируют у них регенерацию клеточной стенки). Затем проводят селекцию трансформированных клеток (см. разд. 4.6).
4.2. Выделение ДНК
Получение хороших препаратов высокомолекулярной ДНК, свободной от РНК и белков, — обязательное условие любого эксперимента по молекулярному клонированию. ДНК должна легко гидролизоваться ферментами рестрикции. Для создания генных банков стрептомицетов в большинстве случаев требуются большие количества ДНК (см. разд. 2.3). Следовательно, если препарат ДНК недостаточно чист и для его гидролиза требуется большой избыток рестриктазы, эксперимент может оказаться слишком дорогостоящим. Кроме того, большинство препаратов рестрикционных ферментов содержат следовые количества экзонуклеаз; добавляя к ДНК избыток рестриктазы, мы неизбежно увеличиваем количество вносимой экзонуклеаз-ной активности. Экзонуклеазы повреждают липкие концы фрагментов ДНК, делая их малопригодными для клонирования. Одним словом, стоит постараться и подойти к процедуре выделения ДНК со всей возможной тщательностью.
4.2.1. Суммарная геномная ДНК
Ниже приведены три метода выделения суммарной ДНК из клеток стрептомицетов (табл. 3). Каждый из них может быть рекомендован к применению в определенных, конкретных условиях эксперимента.
Таблица 3. Выделение суммарной ДНК из стрептомицетов
(метод I)
1. Внесите в 200 мл среды TSB или YEME (в зависимости от штамма — см. текст) 1 мл концентрированной суспензии спор. Инкубируйте на качалке при 30°С.
2. Осадите клетки, когда культура достигнет заметной плотности (обычно для этого требуются 2 дня), путем центрифугирования в 250 мл стакане в роторе Beckman JA14 (или эквивалентном) при 12 000 об/мин (22 100 g) в течение 10 мин.
3. Ресуспендируйте осадок клеток в 10 мл буфера ТЕ, добавьте 10 мг лизоцима и инкубируйте при 30 °С в течение 15 мин.
4. Добавьте 1 мл 20%-ного раствора SDS и аккуратно мешайте пипеткой 15 с. Раствор станет вязким. Немедленно добавьте 10 мл фенола, насыщенного ТЕ, и 1,5 мл 5М NaCl. Осторожно переверните пробирку и верните в исходное положение; повторяйте эту процедуру при комнатной температуре в течение 20 мин.
5. Перенесите смесь в 50 мл полипропиленовую центрифужную пробирку с крышкой и центрифугируйте при 1500 об/мин в течение 10 мин в бакет-роторе в настольной или среднескоростной центрифуге для разделения фаз.
268
Глава 2
Продолжение
6. Отберите вязкий верхний слой с помощью широконосой пипетки и перенесите в чистую пробирку. Не опускайте кончик пипетки близко к интерфазе.
7. Добавьте равный объем хлороформа. Перемешайте содержимое пробирки, аккуратно переворачивая ее в течение 10 мин. Центрифугируйте при 1500 об/мин в течение 10 мин в бакет-роторе (см. этап 5).
8. Отберите вязкий верхний слой и повторите этап 7.
