Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
К настоящему времени об экспрессии генов, участвующих в синтезе антибиотиков, известно относительно немного, однако работы, посвященные клнированию генов, детерминирующих соответствующие биосинтетические процессы, начинают появляться в печати [5, 6]. Недавно [7] в мутантах S. coelicolor удалось клонировать гены всего биосинтетического пути актинородина — антибиотика, в норме продуцируемого S. coelicolor. Клонированные гены были введены в S. parvulus, т. е. в гетерологичного хозяина, в норме не являющегося продуцентом данного антибиотика, после чего трансформированный S. parvulus стал секретировать актинородин. Этот изящный эксперимент продемонстрировал возможности межвидового клонирования
днк.
2. Стратегия клонирования ДНК в стрептомицетах
2.1. Хозяйский штамм
Планирование любого эксперимента по молекулярному клонированию начинается с выбора хозяйского штамма стрепто-мицетов. Этот пункт, возможно, кажется тривиальным, однако довольно часто недооценка его важности приводит к серьезным неудачам. Подходящий штамм можно выбрать, руководствуясь приведенными ниже критериями.
2.1.1. Фенотип хозяина
В большинстве случаев стратегия скрининга банка генов стрептомицетов основывается на фенотипическом выражении клонированного гена. Это означает, что реципиент должен быть дефектным по энзиматической активности, которая могла бы комплементироваться продуктом данного гена, клонированного в подходящем векторе. Например, для того, чтобы клонировать ген лекарственной устойчивости, необходим чувствительный к данному лекарственному агенту хозяин. Клонирование гена, вовлеченного в биосинтез аминокислоты, требует хозяина, специфически ауксотрофного по этой аминокислоте, поскольку не-
Клонирование генов в стрептомицетах
253
обходимо, чтобы отсутствовал продукт этого гена. В первом случае предпочтительнее реципиент, в норме чувствительный к данному лекарственному препарату, так как в этом случае исключается реверсия; чувствительный мутант, выделенный из родительского штамма, имеющий фенотипически выраженную лекарственную устойчивость, может с высокой частотой ревер-тировать к дикому типу и поэтому нежелателен. К сожалению, в случае ауксотрофного хозяина неизбежно приходится работать с мутантом. Здесь следует удостовериться, что частота реверсий данного реципиента к прототрофности относительно низкая. Стандартные методики направленного мутагенеза стрептомицетов с целью получения ауксотрофов описаны в литературе [9]. Потенциальные хозяева должны проверяться на чувствительность к селекционным агентам, обычно используемым в комбинации с векторами для клонирования в стрептомицетах, — тиострептону, неомицину, виомицину и эритромицину.
2.1.2. Эффективность трансформации и эффективность регенерации
Раздел 2.3 касается статистического анализа банков генов. Приведенные в нем данные говорят о том, что если эффективность трансформации протопластов стрептомицетов интактным вектором не превышает 105/мкг (что соответствует приблизительно 103/мкг для вектора в лигазной реакции), то для создания банка генов потребуются неприемлемо большие количества ДНК.
1. Кажущаяся низкая эффективность трансформации может объясняться не собственно нарушением нормального трансформационного процесса, а неэффективной регенерацией трансформированных протопластов. В этом случае для повышения эффективности регенерации можно воспользоваться рекомендациями, приведенными в разд. 4.6.
2. Если недостаточно эффективной оказывается именно трансформация, возможно, потребуется замена вектора. Так, например, 5. rimosus трансформируется нерасщепленными векторами семейства SCP2* с эффективностью, меньшей 103/мкг, тогда как использование репликонов pIJlOl дает величину, превышающую 106/мкг.
3. Если же эффективность трансформации не удается поднять до 105 средствами, предлагаемыми в пунктах 1 и 2, необходимо заменить хозяина.
2.1.3. Активность хозяйских систем рестрикции
Если в соответствии с рекомендациями, изложенными в разд. 2.1.1, планируется использовать гетерологического хозяина, необходимо оценить его рестрикционную активность. Многие представители рода Streptomyces имеют активные системы
254
Глава 2
рестрикции. В особенности это касается промышленных штаммов, которые отбираются с учетом их приспособленности к культивированию в больших ферментерах. Высокая рестрикционная активность защищает их от фаговой инфекции. При использовании этих штаммов в качестве реци-пиентных в экспериментах по молекулярному клонированию донорнаяДНК может распознаваться системами рестрикции как чужеродная и элиминироваться, вследствие чего оказывается невозможным получить представительный банк генов.
Лучший способ проверить наличие рестрикционного барьера между донором и реципиентом заключается в том, что донорный штамм трансформируют плазмидой, выделяют из трансформантов плазмидную ДНК и затем ею трансформируют реципиент-ный штамм. Если рестрикционного барьера нет, эффективность последней трансформации будет сравнима с эффективностью контрольной трансформации, когда плазмиду выделяют из реципиентного штамма и снова вводят в протопласты реципиента. Низкая по сравнению с контрольным экспериментом эффективность трансформации свидетельствует о наличии рестрикционного барьера. Этот способ проверки, однако, неприменим в тех случаях, когда донорный штамм недостаточно хорошо охарактеризован, поскольку возможны технические трудности, связанные с трансформацией донора (например, получение и регенерация протопластов и т. д.).
