Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
4. Среда SP2 аналогична SP1, но в нее не добавляют аминокислот.
¦) Наилучшие результаты нами были достигнуты при использовании солей фирмы BDH; реагенты некоторых других фирм оказались менее пригодными.
бавляется до концентрации 0,5% (по весу). Инкубируйте в 200 мл колбе при 30 °С в течение ночи.
2. Инокулируйте 100 мл той же среды (предварительно подогретой) в колбе на 1 л ночной культурой до ОП6оо от 0,1 до
0,2. Растите в условиях интенсивной аэрации при 37 °С, отбирая аликвоты для измерения ОП каждые 30 мин. При отборе образцов старайтесь останавливать качалку лишь на самое короткое время.
3. В конце логарифмической фазы роста, определяемой по уменьшению скорости прироста оптической плотности, перенесите 10 мл SPl-культуры в 90 мл среды SP2, содержащей 0,5% глюкозы (и 100 мкг/мл тимина, если штамм имеет фенотип Thy-), но не содержащей аминокислот, которые были внесены в среду SP1 на предыдущих этапах культивирования.
4. Инкубируйте БР2-культуру в течение 90 мин. Точное время инкубации, необходимое для достижения клетками состояния максимальной компетентности, в какой-то степени зависит от конкретного штамма, поэтому, если необходимо получить максимально компетентные клетки, следует отбирать образцы через 30-минутные интервалы.
5. Центрифугируйте клетки при 20 °С в роторе Sorvall GSA (или эквивалентном) при 5000 об/мин в течение 10 мин.
6. Ресуспендируйте клетки в 10 мл надосадочной жидкости, предварительно добавив к ней глицерин до концентрации 10% (по объему), быстро разлейте порциями по 0,5 мл в пробирки типа Eppendorf и заморозьте в спиртовой бане с сухим льдом при —70 °С. Клетки сохраняют компетентность по крайней мере в течение 6 месяцев.
\
\
Методы клонирования в бациллах__________________________243-
4.2. Трансформация компетентных клеток
1. Порцию компетентных клеток (0,5 мл) быстро разморозьте на водяной бане при 37 °С.
2. Перенесите клетки в коническую колбу на 50 мл, куда-предварительно внесите 1—5 мкг ДНК в объеме 5—10 мкл.
3. Инкубируйте 1 ч при 37 °С при мягком покачивании.
4. Добавьте 5 мл VY- или L-среды и инкубируйте еще 1,5 ч при 37 °С при энергичном встряхивании.
5. Рассейте культуру на чашки (кровяной агар с триптозой или L-arap) с. подходящим антибиотиком для селекции трансформантов. Тетрациклин, канамицин, эритромицин и хлорам-феникол используются в концентрации 5 мкг/мл; стрептомицин — 30 мкг/мл.
Эффективность трансформации можно существенно повысить, если бактерии высевать на чашки в слое верхнего агара, инкубировать некоторое время, а затем наслаивать агар, содержащий антибиотик [59, 61]. Эта процедура, альтернативная этапу 5, состоит в следующем:
Инкубируйте в течение 30 минут (вместо 1,5 ч — см. выше этап 4) и соответствующие разведения культуры смешайте с 5 мл расплавленного агара при 45 °С. Вылейте каждую смесь, на чашку, содержащую 10 мл того же агара, и инкубируйте при 37 °С в течение 3 ч. Затем добавьте еще по 5 мл агара с антибиотиком; концентрации антибиотиков в среде указаны выше (см. этап 5).
4.3. Получение протопластов
Трансформация протопластов бацилл впервые описана Чангом и Коэном [62]. Преимущество протопластов в том, что они способны акцептировать плазмидную ДНК в форме мономера; при этом реально компетентной оказывается весьма значительная часть популяции протопластов (50%)- Кроме того, этот метод можно использовать для работы с теми многочисленными штаммами, для которых процедура приготовления компетентных клеток не разработана.
Приводимая ниже методика представляет собой модификацию метода Иманаки с соавт. [48]. Преимущество нашей методики состоит в том, что ее можно применять не только для' В. subtilis, но также и для других видов бацилл, таких, например, как В. licheniformis, В. freundenreichii и В. circulans. Единственный параметр, изменяющийся в зависимости от того, какой именно вид бактерий используется в работе, — это продолжительность инкубации в лизоциме, поскольку некоторые бациллы устойчивы к его действию (например, В. sphaerlcus) тогда как другие оказываются гораздо более чувствительными.
16*
244
Глава 1
Таблица 7. Реагенты для трансформации протопластов
SMMLBP приготавливают, смешивая равные объемы 2XSMM и LBP 2XSMM
Сахароза 342 г (1 М)
Малеат натрия 4,72 г (40 мМ)
MgCl2 8,12 г (40 мМ)
Воды до 1 литра; довести pH до 6,5, добавив NaOH Автоклавировать 15 мин при 0,7 атм
LBP представляет собой 2ХЬВ-среду, содержащую поливинилпирролидон в концентрации 80 г/л
Триптон (Difco) 20 г
NaCl 10 г
Дрожжевой экстракт (Difco) 10 г
Поливинилпирролидон 80 г
Воды до 1 литра; автоклавировать 15 мин при 0,7 атм
