Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
2. Рассечение движущегося геля расположенным над ним лезвием (устройства гильотинного типа).
3. Продавливание геля через узкое отверстие.
Многие приспособления изготовлены из проволочек [228, 540] или бритвенных лезвий [53, 190, 227, 1354], укрепленных на определенном расстоянии друг от друга. Недостатки резаков такого типа заключаются в следующем: во-первых, толщина фрагментов геля предопределена заранее; во-вторых, сдавливающие усилия, возникающие при разрезании гелей, вызывают их деформацию и, в-третьих, полученные фрагменты геля иногда трудно отделить от бритв и проволочек. Чтобы предотвратить искривление гелей, было предложено [53, 540] замораживать их перед разрезанием, однако такая процедура сама по себе может привести к искажению зон [005, 777]. Голдбергер :[44(>] создал устройство, состоящее из 50 круглых лезвий, насаженных параллельно друг другу на ось, расположенную эксцентрично по отношению к главному валу. В момент прохождения лезвий через гель им сообщается вращательное движение, что предотвращает деформацию геля. Если концентрация геля составляет менее 5%, перед разрезанием его необходимо выдержать в морозильнике 10 мин, чтобы он затвердел. Мур и Пурпура [882] применили в устройстве Голдбергера хирургические лезвия, сохранив принцип их вращательного действия. Матсу-мура и Нода [837] поместили между бритвенными лезвиями распорные кольца, на которых собирались фрагменты геля, что облегчало их разделение.
Грей и Стеффенсен {470] сначала дегидратировали гели, а затем на роторном микротоме разрезали их на пластинки толщиной 250, 125, 62,5 и менее 50 мкм. Как правило, микротомы
Рас. 74. Устройство для продольного разрезания столбиков геля [357]. Л. Держатель ш плексигласа (2,5X2,5X15,2 см; отверстие длиной 10 см и диамет-:>им 7 мм). Б. Составные части держателя. В. Режущее приспособление с тремя проволоками из нержавеющей стали, расположенными на расстоянии 1,6 мм
друг от друга.
не применяются для фракционирования гелей, так как дают слишком тонкие срезы.
Лёпинг [7771 использовал устройство гильотинного типа для разрезания гелей, предварительно замороженных в сухом льду. Грсссель и Воловельски [477] сконструировали «макритом», на котором можно делать срезы различной толщины в пределах от 0,125 до 2 мм (15 вариантов), что должно удовлетворить практически любые требования к толщине срезов. Разработано также режущее устройство гильотинного типа для пластин геля [428].
В некоторых приспособлениях [122, 436, 490] гель автоматически подталкивается к вращающемуся лезвию, которое разрезает его в поперечном направлении на одинаковые кусочки. В одном из них [490] для замораживания гелей и придания им жесткости используют охлажденный метанол, циркулирующий' в медной рубашке прибора. Бирнбойм [122] создал аппарат, позволяющий разрезать без замораживания даже мягкие гели-(2,7%) на пластинки толщиной 1 мм. Были описаны и другие' основанные на том же принципе, но более простые приспособлен ния [605, 656].
Петерсон и др. [993] изготовили резак с ирисовой диафрагмой, который дает возможность разрезать цилиндрические гели (в том числе и мягкие) длиной 10 см и диаметром 6 мм на кусочки толщиной 1 мм, не прибегая к замораживанию гелей. Позднее этот резак был приспособлен для работы с гелями диаметрами 3, 6 и 18 мм [1293].
Майзель <[800] фракционировал гели путем продавливания их при постоянном давлении и скорости через узкое отверстие. Измельченный гель увлекался током жидкости. Для этой же цели можно использовать и туберкулиновый шприц на 1 мл [515].
Иногда требуется разрезать гель в продольном направлении, чтобы провести радиоавтографию или одновременное окрашивание электрофореграммы несколькими красителями. В литературе описаны аппараты для продольного разрезания как столбиков (рис. 74) .[357], так и пластин [547] полиакриламидного геля.
1.15.7. Выявление радиоактивности после электрофореза
Применение радиоактивных изотопов значительно повышает чувствительность аналитических методов и позволяет проводить такие исследования, которые иначе было бы невозможно выполнить. Поэтому было приложено немало усилий, чтобы разработать методы выявления радиоактивных веществ после электрофореза в различных поддерживающих средах. Чувствительность определения радиоактивности зависит преимущественно от следующих факторов: во-первых, от энергии и природы излучения и, во-вторых, от свойств поддерживающей среды. Па-пример, у-лучи легко обнаружить в любой электрофоретической среде, тогда как для обнаружения (3-излучателей, особенно 3Н, НС и 35S, требуется либо тщательная подготовка опыта, если они определяются с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика, либо высокая концентрация этих изотопов или длительное время экспозиции, если применяется радиоавтография.
Радиоавтография. Преимущества этого метода заключаются в его простоте и возможности использования выделенных фракций для дальнейших исследований. Основной недостаток — это малая чувствительность, особенно для (3-изотопов с низкими энергиями.
