Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Помимо ИЭТ кислотно-основные свойства белков характеризует также изоионная точка. Согласно определению, «изоион-ная точка соответствует pH раствора изоионного белка в воде или в растворе какого-либо другого вещества, которое само по себе при растворении в воде не дает водородных или гидроксильных ионов» [767].
Различие между изоионной и изоэлектрической точками обычно невелико и зависит от концентрации низкомолекулярных ионов, присутствующих в растворе. В экспериментальном отношении изоэлектрическую точку определять проще, чем изо-ионную, однако последняя является более строгим понятием, поскольку отражает истинную кислотность белков.
При разделении смеси белков очень важно знать зависимость электрофоретической подвижности от pH для каждого компонента, особенно в тех случаях, когда требуется выбрать такое значение pH, при котором электрофоретические подвижности компонентов различаются наиболее сильно. Это значение pH было бы идеальным для разделения. Так как лишь в редких случаях зависимость электрофоретической подвижности от pH известна для всех компонентов смеси, приходится подбирать наиболее подходящее значение pH эмпирическим путем в предварительных опытах.
Ценную информацию о кислотно-основных свойствах белков можно получить при помощи кривых титрования. Способность различных групп к диссоциации или присоединению протонов не зависит от того, присутствуют ли эти группы в составе аминокислоты, пептида или белка. Во многих случаях даже константы диссоциации ионизируемых групп мало зависят от влияния других участков молекулы. Таким образом, зная аминокислотный состав белков, можно на основании значений рК' для ионизируемых групп предсказать поведение белков при элект-
Таблица 5
Ионизируемые группы белков и их константы диссоциации (р/С) при 25 °С
Молекулы
Группы Gly (Gly)2 (Gly)3 (Gly)* РНКаза БСА
[332] [332J [332] [332] [1276] [1277].
а-СООН 2,34 3,08 3,26 3,05 3,75 3,75
P/Y-COOH * 9,60 8,26 7,91 7,75 4,0---4,7 3,9---4,0
a-NH2 7,8 7.8
e-NH2 10,2 9.8
Имидазольная 6,5 7.0
Феноксильная 9,95 10,35
Гуанидиловая 12,00 12.00
Сульфгидриль-
ная1*
>) рК для SH-rpycin в пептидах равна 8,5—9t 1 [104],
рофорезе (табл. 6). Однако иногда такое предсказание может оказаться ошибочным. Некоторые глобулярные белки содержат одну или несколько ионизируемых групп, которые не поддаются непосредственному титрованию, поскольку скрыты в глубине молекулы или участвуют в образовании водородных связей. Такие замаскированные группы не влияют на суммарный заряд молекулы нативного белка. Поэтому в действительности этот заряд меньше рассчитанного теоретическим путем. После денатурации: белка замаскированные группы становятся доступными для титрования, вследствие чего электрофоретическое поведение белков, может измениться. Так, например, миоглобин содержит один* надцать остатков гистидина, однако пять из них можно оттитровать только после денатурации миоглобина.
Биологически активные формы белков часто состоят из нескольких идентичных или различающихся полипептидных цепей. Обычно полипептидные цепи удерживаются вместе в результате образования нековалентных связей, но иногда связь между цепями имеет ковалентную природу (например, осуществляется с помощью дисульфидных мостиков). Хотя в основном поведение белков при электрофорезе определяется их аминокислотным составом, во многих электрофоретических процессах важную роль, играют также (помимо уже упоминавшихся замаскированных групп) третичная и четвертичная структура белков. Дело в том, что изменение конформации молекулы может вызывать изменение ее размеров, а это имеет существенное значение в тех случаях, когда при электрофорезе в качестве дополнительного фактора разделения используется эффект молекулярного сита.
Изменения молекулярной структуры разделяемых белков могут привести к их необратимой инактивации. Этот фактор обязательно нужно учитывать, если электрофорез проводится с целью выделения активных веществ или изучения ферментов. Поэтому для предотвращения денатурации следует подбирать такую буферную систему, которая обеспечивала бы минимальное-нагревание белка, а также минимальное его окисление или восстановление.
С другой стороны, в результате денатурации белки часто приобретают свойства, значительно улучшающие их электрофоретическое разделение. Этот факт используется в тех методах электрофореза, в которых проводят предварительное восстановление белков и комплексирование их с ДСН. Электрофоретическая миграция таких комплексов зависит от эффекта молекулярного сита, свойственного полиакриламидному гелю, и размеров молекул, что создает основу для весьма простого и эффективного метода определения молекулярной массы белков (подробное описание метода см. в гл. II.2).
