Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Самым быстрым методом обесцвечивания фона является электрофоретическое удаление несвязанного красителя. В одном из его вариантов молекулы красителя перемещаются в том же направлении, в котором ранее двигались макромолекулы в процессе их разделения. Такое «продольное» обесцвечивание [281, 1034] проводят следующим образом. Окрашенные цилиндрические гели помещают в стеклянные трубки, внутренний диаметр которых несколько больше, чем диаметр самих гелей. Свободное пространство между гелем и стенкой трубки заполняют свежим гелеобразующим раствором. После его застывания трубки вставляют в обычный аппарат для диск-электрофореза и проводят электрофорез до тех пор, пока фон не станет светлым. Аналогичные результаты удается получить и без заключения окрашенного столбика в новый гель. Достаточно просто вставить его в стеклянную трубку, у которой дно затянуто диализной мембраной или закрыто пробкой из геля, а пространство между
стенками трубки и столбиком заполнить раствором уксусной кислоты. Электрофорез проводят обычным способом до получе-ния бесцветного фона.
Другой вариант электрофоретического обесцвечивания осно' ван на миграции молекул свободного красителя в направление перпендикулярном движению макромолекул при их разделении. Такой метод «поперечного» электрофореза обеспечивает быстрое удаление несвязанного красителя.
Швабе 1[1151] разработал простое устройство для поперечного электрофоретического обесцвечивания цилиндрических гелей. Анодное и катодное пространства разделены между собой вертикальной перегородкой, в которой сверху вниз прорезаны сквозные пазы. Гели плотно вставляют в эти пазы таким образом, что электродные камеры, заполненные 5%-ной уксусной кислотой, оказываются герметично отделенными друг от друга. Обесцвечивание занимает 6 мин. Как уже отмечалось вышег этот аппарат был использован и для электрофоретического окрашивания гелей [1151]. Таким образом, обе операции — окрашивание и обесцвечивание—можно выполнить за несколько минут.
В литературе описан и ряд других типов приборов для элек-трофоретического обесцвечивания (см., например, [363, 838, 955г 991, 1040]).
Вард [1373] предложил еще одно приспособление для поперечного электрофоретического обесцвечивания, очень сходное с аппаратом Швабе [1151], но отличающееся от него конструкцией поддерживающей стойки для столбиков геля. После электрофореза гели помещают в эту стойку и в ней осуществляют все последовательные операции — окрашивание, быстрое обесцвечивание и фотографирование гелей.
Позднее экспериментальным путем было доказано, что нет никакой необходимости создавать герметическую перегородку между анодным и катодным сосудами. Поэтому электрофоретическое обесцвечивание можно проводить очень примитивным способом. Гели кладут в ванночку с разбавленной уксусной кислотой и электродами и включают электрический ток. Удаление красителя при этом действительно ускоряется, но, конечно, не в такой степени, как в более сложных установках.
Многие фирмы производят различные типы приборов для обесцвечивания столбиков и пластин геля.
Описаны также удобные методы [183, 898] быстрого электрофоретического удаления избытка красителя из полосок геля.
Сравнивая электрофоретическое обесцвечивание с диффузи-онным, следует отметить, что, хотя первая процедура обеспечивает резкое ускорение процесса и получение светлого фона, она может сопровождаться потерей отдельных слабых полос и по-
степенным снижением интенсивности окраски разделенных зон. В некоторых случаях во время электрофоретического обесцвечивания наблюдалась даже миграция окрашенных белков {106, 826]. С другой стороны, удаление красителя простым вымачиванием гелей занимает очень много времени и дает менее светлый фон, но зато требует меньше усилий. Учитывая, что у каждой из этих методик есть свои преимущества, оптимальный способ обесцвечивания в каждом конкретном случае следует выбирать экспериментальным путем.
1.15.3. Сканирование окрашенных электрофореграмм
Одним из часто применяемых методов оценки и документации результатов электрофоретического разделения в твердой поддерживающей среде служит денситометрическое сканирование электрофореграмм. Для его осуществления в продаже имеются разнообразные денситометры.
Принцип действия и конструкция этих приборов очень пробсты. Электрофореграмма перемещается с постоянной скоростью и в определенной точке освещается хорошо сфокусированным и ‘Стабилизированным узким лучом света. Интенсивность прошедшего через нее или отраженного ею света непрерывно измеряется и регистрируется. При сканировании непрозрачных электрофореграмм используют лишь отраженный свет; если же электрофореграмма прозрачна, то можно измерять как отраженный, так и проходящий свет. Однако обычно в этом случае сканирование проводят в проходящем свете. Интенсивность света регистрируют с помощью самописца. Так как лента самописца движется со скоростью, равной или пропорциональной скорости перемещения электрофореграммы, одна из координат записи -соответствует расстояниям, измеряемым на электрофореграмме. По другой оси координат наносятся величины оптической плотности, измеренные на заданном расстоянии от стартовой линии. Таким образом, в принципе площадь пика должна быть прямо пропорциональна количеству вещества, находящегося в соответствующей полосе. Однако по причинам, рассмотренным ниже, необходимо каждый раз тщательно проверять, действительно ли это так.
