Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Суммируя описанные выше электрофоретические свойства белков, можно сказать, что наиболее важное значение с точки зрения электрофореза имеют число и характер ионизируемых групп, присутствующих в молекуле белка. Знание аминокислотного состава белков позволяет сделать определенные выводы, помогающие выбрать наиболее подходящую систему для электрофоретического разделения. В некоторых методах электрофореза очень существенную роль играют также размеры и конформация белковой молекулы. Влияние этих молекулярных параметров на разделение зависит от среды, используемой для электрофореза, поэтому оно будет обсуждаться в разделах, посвященных детальному описанию отдельных методов.
Свойства белков и те разнообразные воздействия, которые оказывает на их разделение применяемая при электрофорезе среда, позволили разработать большое число самых разных электрофоретических методов. По принципу разделения все они распадаются на четыре основные группы:
1. Электрофорез в среде с постоянным значением pH. Разделение основано на различиях в заряде индивидуальных компонентов при данном pH.
2. Изоэлектрическое фокусирование. Разделение проводится в градиенте pH и основано на различиях в значениях ИЭТ отдельных компонентов.
3. Электрофорез в средах, обладающих свойствами молекулярного сита. При зональном электрофорезе в геле, используемом в качестве носителя, эффект молекулярного сита может служить дополнительным фактором, улучшающим разделение нативных белков. Кроме того, эффект молекулярного сита мо-
жет быть единственным механизмом, лежащим в основе разделения белков. В этом случае путем комплексирования белков с анионным (реже с катионным) детергентом (см. гл. II.2) обеспечивается приблизительно одинаковое для всех белков отношение заряда к массе.
4. Изотахофорез. При разделении белков этим методом зоны распределяются в соответствии с их подвижностью и мигрируют с одинаковой скоростью.
Качество фракционирования можно повысить путем одновременного или последовательного применения нескольких указанных выше принципов электрофореза. Так, например, на первом этапе разделения используют электрофокусирование в геле, а на втором — электрофорез в среде, обладающей свойствами молекулярного сита. Можно также провести на первом этапе электрофорез в среде с постоянным значением pH, а на втором — электрофорез в присутствии анионного детергента и т. п. (см. гл. II.3).
Благодаря существованию огромного числа вариантов, а также возможности одновременного или последовательного применения различных принципов электрофорез стал одним из наиболее универсальных методов разделения белков для аналитических и препаративных целей.
11.2. Разделение белков в соответствии с размерами молекул: определение их молекулярной массы
Методические преимущества электрофореза в полиакриламидном геле навели исследователей на мысль о создании таких его вариантов, которые позволили бы определять молекулярную массу макромолекул и в первую очередь белков. В разд. 1.11.1 подробно обсуждался вопрос о том, что при электрофорезе в полиакриламидном геле разделение макромолекул зависит как от их размеров, так и от заряда. Отсюда следует, что для определения молекулярной массы необходимо исключить влияние заряда. Для этой цели разработано множество методов, которые можно разделить на две группы. В методах первой группы для определения молекулярной массы используют коэффициент задержки Л\. Зависимость между Кт и молекулярной массой изучена еще недостаточно хорошо, и для ее выражения был предложен целый ряд уравнений [612, 1106, 1289, 1296]. Хедрик и Смит [538] построили графики зависимости коэффициентов задержки, определяемых по кривым Фергюсона, от молекулярной массы белков и обнаружили между ними линейную зависимость (рис. 75). Поскольку коэффициент задержки является функцией размера, а не массы молекулы [5, 1186, 1366], некоторые белки ведут себя аномально при электрофорезе, если отличаются от большинства других белков по форме молекулы или парциальному удельному объему. Так, например, полимеры ферритина и альбумина дают соответственно более низкие и более высокие значения Кг, чем можно было бы ожидать, исходя из их молекулярных масс [92, 538].
Так как при электрофорезе в полиакриламидных гелях, имеющих различные размеры пор, существует обратная зависимость между подвижностью белков и сопротивлением трения (см. разд. 1.11.1), при наличии соответствующей калибровочной кривой молекулярные массы белков можно определять по их относительной подвижности. Между фрикционным отношением и логарифмом молекулярной массы была обнаружена линейная зависимость [971, 1483], (рис. 76).
Описанные методы имеют то преимущество, что они позволяют также определять с точностью до 5% молекулярные массы белков, содержащих дисульфидные связи или состоящих из не-
| | i | | i *¦
О Ю 20 30 40 50
Молекулярная mqccq
Puc. 75. Зависимость между наклоном кривой логарифмов подвижности (см. рис. 30) и молекулярной массой белков [538]. 1 — димер пепсина; 2 —оваль-бумин; 3 — а-амилаза; 4 — мономер альбумина; 5 — трансферрин человека; в — яичный трансферрин; 7 — гексокиназа; 8 — лактатдегидрогеназа; 9 — кетозо-1-фосфат—альдолаза; 10—Р-амилаза; 11 — никотинамидаза; 12 — а-уреаза; 13 — каталаза; 14—ксангииоксидаза; 15—мономер апоферритина (ферри-
