Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Генри вывел уравнение для подвижности проводящей частицы в проводящем растворе, считая релаксационный эффект пренебрежимо малым:
где tf>(r)— потенциал в ионной атмосфере, a Z—потенциал на поверхности сдвига. В растворе электролита макромолекуляр-ная частица окружена слоем прочно связанной с ней воды, которая не может перемещаться независимо от частицы. В действительности потенциал, определяющий скорость электромиграции, есть потенциал на границе связанной и свободной жидкости— поверхности сдвига. Заряд внутри этой поверхности определяет дзета-потенциал (электрокинетический потенциал). Он может отличаться от суммарного заряда частицы, так как под указанной поверхностью могут находиться некоторые ионы, входящие в состав ионной атмосферы.
Приняв, что электрокинетический потенциал мал, и применив теорию межионного взаимодействия Дебая и Хюккеля, уравнение Генри можно упростить:
а
и
со
къа&
<6>
ОО
л___ 8яА^е2
К “ lOOODkT ‘U’
где е — элементарный заряд, N — число Авогадро, \i — ионная
1 i 0
сила, определяемая по уравнению где Zi — валент-
ность i-то иона с молярной концентрацией Ci. Величина 1/к измеряется в сантиметрах, и ее значение отражает толщину ионной атмосферы. Вопрос о применимости уравнения Генри для вычисления ? из экспериментально определенных величин электрофоретической подвижности детально рассмотрен в другой работе [954].
Из приведенного уравнения вытекает, что электрофоретическая подвижность убывает при возрастании ионной силы. И хотя отдельные экспериментальные данные противоречат этому утверждению, их 'можно объяснить либо влиянием высокой ионной силы на другие параметры макромолекулярной частицы, например на размер и форму молекулы, либо специфическим связыванием некоторых ионов с макромолекулой.
Существуют три основных типа электрофоретических систем — электрофорез с подвижной границей (метод подвижной границы), зональный электрофорез и стационарный (или вытесняющий) электрофорез. В системах первого типа электрическое поле прикладывается к исходно резкой границе между раствором макромолекул и буфером. Скорость миграции заряженных частиц определяется путем наблюдения за перемещением этой границы. Если раствор содержит гетерогенную смесь ионизированных макромолекул, то можно увидеть множество движущихся границ. В такой системе индивидуальные компоненты нельзя разделить на отдельные зоны, так как наслоенный сверху буферный раствор имеет более низкую плотность по сравнению с находящимся под ним раствором макромолекул. Если бы и удалось достигнуть разделения зон, то все равно произошло бы их перемешивание, так как плотность раствора внутри этих зон была бы выше, чем между ними.
В случае зонального электрофореза смешивание разделенных зон может быть предотвращено. Существует несколько способов получения стабильных зон. В свободном растворе зоны можно стабилизировать с помощью вращения или непрерывного потока тонкого слоя жидкости (гл. 1.3). В качестве среды для зонального электрофореза могут успешно применяться градиенты плотности (гл. 1.4). Но наиболее широко исполь-
зуемый вариант зонального электрофореза основан на применении пористой стабилизирующей среды, такой, как фильтровальная бумага, блоки гранулированного материала или различные гели (гл. 1.5—1.11).
Электромиграция третьего типа (стационарный, или вытесняющий, электрофорез) характеризуется тем, что через некоторое время после начала разделения зон устанавливается состояние равновесия, при котором ширина зон в дальнейшем не изменяется. К электрофорезу такого типа относятся два метода: изоэлектрическое фокусирование (гл. 1.12) и изотахофорез (гл. 1.13).
1.2. Электрофорез с подвижной границей
Электрофорез макромолекул, растворенных в соответствующем буфере, проводится в U-образной кювете с прямоугольным поперечным сечением, как показано на рис. 1. В нижнюю секцию и в одно из колен помещают исследуемую пробу (рис. 2). Предварительно ее диализуют против буфера, которым заполняют остальной объем кюветы. Ход опыта показан на ряс. 3. Видно, что в каждом случае ниже границы раздела жидкостей находится раствор с более высокой плотностью, а выше — раствор с менее высокой плотностью, что предотвращает конвекцию в вертикальном направлении. Но когда через кювету проходит электрический ток, джоулево тепло создает разность температур между центром кюветы и ее стенками. В результате образуется горизонтальный градиент плотности, который может стать причиной восходящих токов в центре кюветы и нисходящих — вдоль ее стенок. Такие различия в плотности снижаются до минимума, если поместить кювету в баню, термостатированную при температуре максимальной плотности буфера ( + 2°С). Небольшие колебания этой температуры уже не приводят к заметным изменениям плотности. После того как Тизелиус предложил использовать кювету с прямоугольным поперечным сечением для эффективного охлаждения раствора в низкотемпературной бане, электрофорез с подвижной границей стал очень точным и быстрым аналитическим методом. Из-за диффузии границы раздела жидкостей никогда не могут быть идеально резкими. Способы наблюдения за приграничными изменениями концентрации вещества основаны на измерении градиента показателя преломления [48, 779, 797], который пропорционален градиенту концентрации (рис. 3). Сконструированная Филпо-том и Свеносоном астигматическая фотокамера со специальной оптической системой, называемой шлирен-оптикой, позволяет непосредственно регистрировать градиент показателя преломления вдоль кюветы (рис. 5).
