Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Этот прибор относительно прост, дает воспроизводимые результаты и может быть использован также для изоэлектриче-ского фокусирования в градиенте плотности.
Существует и другое приспособление с поршневой системой для заполнения и освобождения колонки [870]. Но несмотря на наличие общих черт, его конструкция существенно отличается от описанной выше [985].
Корант И' Лонберг-Холм [709] описали очень простое устройство длй электрофореза и изоэлектричеокого фракционирования в градиенте плотности. В этом приборе миграция макромолекул проходит в трубке длиной 20 см с внутренним диаметром 0,6 ом, а время, необходимое для проведения зонального электрофореза, составляет около 3,5 ч. Некоторые технические подробности этого устройства приведены в гл. L12.
Как уже отмечалось, качество разделения при проведении электрофореза в градиенте плотности сахарозы зависит от толщины стартовой зоны, которая в свою очередь определяется конструкцией аппарата и способом введения пробы. Однако даже в идеальных условиях стартовая зона, как правило, составляет несколько миллиметров, и в целях повышения разрешающей силы электрофореза ее желательно уменьшить. Принцип диок-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет создавать очень тонкие стартовые зоны путем концентрирования белков, находящихся в исследуемом растворе. Именно поэтому он дает более эффективное разделение по сравнению с зональным электрофорезом в градиенте плотности. С другой стороны, извлечение белков из узких зон в полиакриламидном геле сложнее, чем из растворов с градиентом плотности. Процедура, сочетающая преимущества обоих методов, позволяет получать узкие стартовые зоны и легко выделять разделившиеся вещества из градиента плотности. Шастер и Шрир [1150] описали очень простой прибор для практического воплощения этой идеи. Электрофорез проводили в U-образной трубке. В обоих ее коленах над колонкой с градиентом плотности помещали слой полиакриламидного геля. Зоны, разделенные в геле, мигрировали затем в градиент плотности, где расширялись не более чем в 2—3 раза по сравнению с их толщиной в геле. Эта установка отличается довольно большой емкостью; за один прием авторам удалось разделить 50 мг бычьего сывороточного альбумина, и, по их мнению, емкость должна быть еще больше при разделении более сложной смеси белков.
Для работы в системе полиакриламид — градиент сахарозы фирма ISCO выпускает разделитель ELECTROSTAC, являющийся частью прибора для электрофореза модели 212 той же фирмы {рис. 54 в гл. L12). Применение этого прибора подробно описано Эллингтоном и Ароном [25].
Оценка результатов экспериментов, осуществляемых в градиенте плотности, может быть почти полностью автоматизирована. В большинстве случаев градиентные растворы откачивают из колонки -при помощи непульсирующего насоса в проточ-ную кювету фотометра, снабженного самописцем, регистрирующим концентрацию белка. Аналогичным образом, используя соответствующие измерительные ячейки, можно непрерывно записывать проводимость или радиоактивность вытекающей жидкости. Наконец, полученные жидкие фракции могут быть собраны автоматически.
3—2295
1.5. Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой. Общие соображения
Самый простой способ обеспечения стабильности электрофоретических зон заключается в том, что в среду для электрофореза вводят вещества, образующие капиллярную структуру. Ан-тиконвекционные свойства такой системы весьма высоки, если площадь поперечного сечения капилляров достаточно мала, так как в канале круглого сечения скорость потока снижается пропорционально четвертой степени радиуса. В качестве поддерживающей среды чаще всего используются фильтровальная бумага, пленки из ацетата целлюлозы, колонки или блоки целлюлозного порошка, гранулированный крахмал или гранулы поливиниловых полимеров, а также агаровый, агарозный, крахмальный или полиакриламидный гели. Зональный электрофорез в поддерживающей среде имеет ряд важных преимуществ. При его проведении можно использовать какой-либо простой и сравнительно недорогой прибор и анализировать одновременно несколько различных препаратов. Процедуры визуализации зон и выделения фракций осуществляются довольно легко. Вещества, обладающие биологической активностью, можно выявить непосредственно на электрофореграммах. Метод легко приспособить как для крупномасштабного разделения веществ, так и для микроразделения. Удается достигнуть очень высокой разрешающей силы, особенно в среде, характеризующейся одновременно антикон'векцион'ными свойствами и эффектом молекулярного сита.
Теоретические выводы для электрофореза в свободной среде непосредственно не применимы к зональному электрофорезу в поддерживающей среде. Первое осложнение связано с геометрическим эффектом структуры среды, из-за которого заряженные частицы и электрический ток должны проходить через извилистые каналы, что существенно отличается от перемещения в гомогенной среде. Если среда обладает свойствами молекулярного сита, то это, конечно, может заметно изменить подвижность макромолекулы по сравнению с предсказанной на основании суммарного электростатического заряда. Еще одно важное осложнение возникает из-за наложения электрооомоти-ческого потока буферного раствора на электрофоретическое
