Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
ТИПЫ ПРИБОРОВ ДЛЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ
Для проведения зонального электрофореза в градиенте плотности были разработаны приборы разных типов. Сведения о приборах, предложенных в начальном периоде применения этого метода, содержатся в обзорах Колина [703] и Свенссона [1259]. Ниже будут описаны лишь 'некоторые другие типы приборов.
Специальный прибор для электрофореза в градиенте плотности был сконструирован Свенссоном и др. [1259, 1264, 1265]. Электрофорез проводится в вертикальной стеклянной колонке, снабженной охлаждающей рубашкой для достижения хорошего термостатироваиия. Платиновые электроды помещают в боковые трубки, одна из которых при помощи жидкостного контакта соединяется с нижней, а другая — с верхней частью разделительной колонки. Применение отдельных электродных сосудов позволяет удалять пузырьки газа, не нарушая градиента плотности. Фракционирование градиента после проведения разделения осуществляется через капиллярную трубку, введенную в нижнюю часть колонки. Для заполнения колонки градиентом и для внесения исследуемого образца используется дополнительный сосуд, работающий по принципу Мармотта. Описанное устройство было слегка модифицировано Чарлвудом и Гордоном .[222].
Фирмой LKB (Швеция) был создан универсальный прибор, пригодный для всех видов электрофореза и изоэлектрического фокусирования, проводимых в колонках, независимо от того, используются ли при этом в качестве поддерживающей среды порошки, гели или градиенты плотности. Название «Унифор» l«Uniphor») говорит об универсальности прибора. Его конструкция и использование применительно к различным методикам подробно описаны Берграмом [111]. Разделение происходит в термостатированной стеклянной трубке, длина которой может изменяться в определенных пределах. С обоих концов трубка закрыта специально разработанными устройствами — «проточными соединителями», являющимися основными частями прибора. В них находятся мембраны, которые разделяют между собой буферные растворы в колонке и электродных сосудах, обеспечивая в то же время электрический контакт между ними. В нижнем проточном соединителе имеется пористый диск, удерживающий порошок или гель в колонке. В нем расположена, кроме того, капиллярная трубка, служащая для опорожнения колонки. Пузырьки газа, образующиеся в результате электролиза, протекающего одновременно с электрофорезом, удаляют путем непрерывного прокачивания буфера из электродных сосудов малого объема в специальные резервуары. В верхний соединитель также помещена капиллярная трубка, которая может быть использована для введения ппобы в колонку или для элюции. Прибор «Унифор» фирмы LKB позволяет исследовать 1—5 мл раствора, содержащего 50 мг белка. Белки сыворотки крови можно разделить в нем методом электрофореза в градиенте плотности сахарозы за 42 ч.
Прибор, разработанный фирмой Instrumentation Specialities Company (ISCO, США), дает возможность наблюдать за зонами белка в процессе электрофореза при помощи оптического устройства [163]. Он описан в гл. 1.12.
На рис. 9 изображен прибор для зонального электрофореза в градиенте плотности [985]. Основной его частью является J-образная трубка, основание которой заполнено пробкой из полиакриламидного геля. В коротком колене трубки над пробкой геля находится насыщенный раствор хлористого натрия, в который погружен один из электродов. В длинном колене поверх трубки помещают слой забуференного насыщенного раствора сахарозы, а остальную часть этого колена используют как градиентную колонку. Для ее заполнения и опорожнения служит поршень, соединенный с градиентным смесителем или коллектором фракций при помощи гибкого пластмассового шланга. Кроме того, в поршне просверлены отверстия, которые заполняют забуференным полиакриламидным или агарозным гелем для обеспечения электрического контакта с на-
Рис. 9. Прибор для электрофореза в градиенте) плотности в начале электрофоретического разделения [985]. А. J-образная трубка. Б. Составные части поршня. 1 — аппарат для создания градиента плотности; 2 — двухходовой кран; 3 — трехходовой кран; 4 — пластмассовый шприц для внесения пробы; 5 — пропускание воздуха для перемешивания раствора при формировании градиента; 6 — ось редуктора, понижающего число оборотов мотора; 7—нитка; 8 — анодная платиновая спираль; 9 — градиент; 10 — поршень; 11 — проба в выбранном положении; 12—насыщенный раствор сахарозы; 13 — пробка из полиакриламидного геля; 14 — насыщенный раствор хлористого натрия; 15 — катод; 16 — водяная рубашка для термостатировання; 17—пластмассовая трубка; 18 — зубчатая насечка; 19 — пробка из полиакриламида или агарозы; 20 — уплотнительное кольцо; 21 — наконечник для присоединения пластмассовой трубки.
холящимся непосредственно над ним верхним электродным буфером. При создании градиента плотности можно воспользоваться градиентным смесителем любого другого типа вместо изображенного на рис. 9. Для внесения исследуемой пробы служит шприц.
По окончании разделения поршень при помощи стеклянного стержня вдавливают внутрь колонки ступенями по 0,5 или 1 см и собирают фракции раствора, вытекающие через пластмассовый шланг.
