Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Применение антибиотиков
Несомненно, что столь широкое развитие метода культуры ткани и клеток оказалось возможным благодаря открытию антибиотиков и тому факту, что некоторые из них при добавлении в питательную среду в бактерицидных концентрациях не влияют на жизнеспособность клеток и тканей. Следует, конечно, помнить, что на раннем этапе работа в этой области (а было сделано немало) проводилась без антибиотиков и тем не менее успешно. Это объясняется тщательной стерилизацией материалов и соблюдением всех правил асептики. И хотя в настоящее время антибиотики входят в состав почти всех питательных сред, нет оснований отказываться от соблюдения обычных асептических мер. В борьбе с бактериальной инфекцией не следует полагаться только на антибиотики, ибо это порождает неряшливость в работе; антибиотики добавляют не для того, чтобы убить в среде микроорганизмы, попавшие туда в результате грязной работы, а для защиты от воз-
можного случайного заражения. Кроме того, нужно иметь в виду, что антибиотики, как следует из самого названия, не абсолютно безвредны для клеток.
Компоненты среды
Среда, наиболее пригодная для культивирования макрофагов чело(века и животных, должна содержать следующие (компоненты.
а) Компоненты определенного химического состава. Это может быть либо среда Игла, либо среда 199. Обе эти среды готовятся на сбалансированном солевом растворе и содержат феноловый красный, как индикатор pH. Стерилизуют их с помощью мембранных фильтров. Среду Игла (основную) и среду 199 лучше получать в виде десятикратных концентратов без бикарбоната и антибиотиков. Такие концентраты можно хранить в холодильнике при +4°С (от 2 до 10 °С) в течение 3 мес. Рабочие растворы получают разведением концентратов стерильной бидистиллированной водой.
б) Естественные компоненты. Для культивирования макрофагов мыши вполне пригодна телячья сыворотка; при культивировании макрофагов человека используют гомологичную сыворотку, макрофагов кролика — аутологичную. Телячью сыворотку можно хранить в холодильнике при +4°С в течение года. Человеческую сыворотку получают в гематологических отделениях больших клиник.
в) Гепарин. Это вещество в очень низких концентрациях используется для того, чтобы предотвратить слипание клеток. Хранят его в стеклянных ампулах на 5 мл (1000 ед./мл) в обычном холодильнике. Остатки содержимого вскрытой ампулы переносят для хранения в стерильный контейнер.
г) Антибиотики. Для подавления роста грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий используют пенициллин и стрептомицин. 1 ООО ООО ед. пенициллина и 1000 000 мкг стрептомицина растворяют в 100 мл воды, и такой основной раствор хранят в обычном холодильнике.
д) Раствор бикарбоната натрия. 4,4 г бикарбоната натрия и 1,0 мг фенолового красного растворяют в
100 мл воды и через раствор пропускают двуокись углерода до тех пор, пока он не приобретет янтарный цвет с легким розоватым оттенком. Раствор разливают в маленькие флаконы по 5 мл, закрывают и стерилизуют в автоклаве.
Реактивы смешивают в асептических условиях в следующих пропорциях в указанном порядке:
а) Разбавленная среда определенно-
МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МАКРОФАГОВ
Ниже подробно описываются методы получения и культивирования макрофагов из перитонеальной полости мыши и из перитонеального диализата, взятого у человека и из легкого кролика.
МАТЕРИАЛ ИЗ ПЕРИТОНЕАЛЬНОЙ ПОЛОСТИ МЫШИ
В разделе, посвященном получению макрофагов, уже отмечалось, что данный источник в настоящее время используется наиболее широко. В равной мере пригодны мыши любой линии и обоего пола. Возраст мышей должен быть около 6 нед, так как выход макрофагов в этом случае выше, чем при использовании более молодых или более старых животных. От таких мышей получают достаточно много клеток, поэтому в большинстве случаев нет необходимости прибегать к предварительной внутрибрюшинной инъекции чужеродных (веществ.
Приготовление рабочей среды
го состава ........................
б) Сыворотка..........................
в) Раствор гепарина...................
г) Раствор антибиотиков ..............
д) Раствор бикарбоната натрия . .
90 мл 10 мл 1 мл (10 ед./мл)
1 мл
Его добавляют по каплям до тех пор, пока желтый цвет смеси не потемнеет до янтарного со слегка розоватым оттенком, что соответствует pH 7,2,
Принцип метода очень прост. Соблюдая правила асептики, в брюшную полость только что забитых животных вводят среду с небольшим количеством стерильного воздуха; после этого стенку брюшка слегка массируют. При этом жидкость равномерно распределяется по брюшной полости и в нее попадают макрофаги, высвобождающиеся из брюшины. Образующуюся суспензию отсасывают шприцем. Обычно объем получаемой суспензии составляет около 85% объема инъецированной среды. На практике вводят 3,5 мл среды и получают от каждой мыши около 3 мл суспензии. Число мышей определяется объемом суспензии, необходимой для опыта, а объем этот в свою очередь зависит от числа культур и типа сосудов, используемых для культивирования. Для посева в простые пробирки или пробирки Лейтона требуется 1 мл суспензии, в камеру Тревана и Робертса — 0,2 мл, в камеру Приора — 0,25 мл Круик-шенка, Купера и Конрана — 0,25 мл, Круикшенка—Сте-рилина — 0,16 мл, а для каждой лунки камеры Уосли— 0,2 мл.
