Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
в газовом пространстве, а также вводить в него экспериментальную смесь газов (назовем их газовыми иглами).
Камеру помещают в чашку Петри и стерилизуют в собранном виде (вместе со смазанными покровными стеклами, газовыми иглами, на концы которых одевают маленькие стеклянные трубочки, и зажимными винтами, которые, однако, не должны быть затянуты; их затягивают лишь после того, как камера остынет). Ватные фильтры, помещенные в короткие поливиниловые или стеклянные трубки, стерилизуют отдельно в автоклаве, а затем соединяют с газовыми иглами. Камера вмонтирована в металлическую пластину (рис. 5.4). В собранную таким образом камеру помещают клетки для культивирования. В небольшой стерильный шприц с иглой длиной 38 мм и диаметром 0,55 мм набирают клетки, суспендированные в питательной среде, в определенной концентрации. Колпачок одной из трубочек обжигают в пламени горелки и снимают; также обжигают конец трубочки и проводят в него иглу, чтобы кончик ее достиг центральной части камеры. Благодаря зазору между стенками трубочки и иглой, а также эластичности резины можно, манипулируя шприцем, коснуться кончиком иглы любого из покровных стекол (необходимо соблюдать осторожность, чтобы случайно не поцарапать стекло). Обратив скос иглы вверх и подводя ее ближе к верхнему стеклу, выпускают немного суспензии, так чтобы на верхнем покровном стекле возникла висячая капля. Постепенно количество суспензии, заполняющей камеру, увеличивают, пока капля не коснется нижнего покровного стекла. Для того чтобы целиком покрыть несмазанную центральную часть обеих стенок камеры и таким образом заполнить ее, для камеры Тревана и‘Робертса требуется 0,2 мм суспензии, а для камеры Приора — около 0,25 мл. (Следует отметить, что введение суспензии не увеличивает давления в камере, поскольку она связана с окружающей средой через газовые иглы.) Заполнив камеру, извлекают трубочку и колпачок, снова обжигают и трубочки закрывают колпачком. Камеру помещают в стерильный контейнер для инкубации.
При пользовании обычным микроскопом вначале камеру инкубируют в перевернутом положении, чтобы клетки оседали на верхней стенке. Через 2—3 ч макрофаги прикрепляются, и инкубацию можно продолжать при обычном положении камеры.
Когда камера прогреется до температуры термостата, примерно ко времени прикрепления макрофагов, ее заполняют газом. Это можно производить периодически (как при культивировании клеток в пробирках), или непрерывно. В первом случае через одну из газовых игл с фильтром подают теплую газовую смесь, а содержимое газового пространства (сначала это воздух) выпускают через другую иглу; затем подачу газа на 'некоторое время прекращают и продолжают инкубацию. При непрерывном заполнении газовую смесь перед введением в камеру насыщают водяным паром и прогревают, пропуская через промывалку при температуре на несколько градусов выше температуры камеры. Выпускную иглу соединяют с трубкой, которую погружают в неглубокий сосуд с водой, что позволяет непосредственно наблюдать за поступлением газа и поддерживать в камере постоянно небольшое избыточное давление. При таком способе система газовых игл обеспечивает постоянное поддержание оптимальной физиологической атмосферы в газовом пространстве. С равным успехом ее можно использовать для создания в газовом пространстве особой «экспериментальной» атмосферы.
Периодическая смена среды и добавление в культуру различных агентов осуществляются через те же трубочки. Эти операции следует выполнять очень осторожно, чтобы не повредить прикрепившиеся клетки. Для постоянной перфузии культуры нормальной или специально измененной средой одновременно используются обе трубочки. Перфузию осуществляют, нагнетая или отсасывая среду при помощи небольшого перепада давления; важно только, чтобы скорости притока и оттока были одинаковыми.
После окончания культивирования верхнее покровное стекло снимают, прикрепившиеся клетки фиксируют и окрашивают для микроскопического исследования, как три использовании покровных стекол.
Выше уже упоминалось, что в камере Приора направляющие трубочки расположены по концам диаметра, напротив друг друга, тогда как в исходной модели они находятся под углом 60°; было отмечено, что подобная модификация связана с определенными трудностями при работе. Очевидно, что расположение трубочек в камере Приора способствует более равномерному распределению жидкости при постоянной перфузии и в этом отношении представляется усовершенствованием. Однако, когда камера вмонтирована, направляющие трубочки лежат прямо на пластине (рис. 5.5), и ясно, что при минимальной высоте установки зазор между колпачками трубочек и пластиной очень мал. Это обстоятельство несколько затрудняет снятие и надевание колпачков и, что более серьезно, может привести к перегреву камеры при пользовании пламенем для обжигания трубочек и колпачков. Легко видеть, что при работе с исходной моделью, где трубочки расположены по-иному и форма основания другая (рис. 5.4), подобные трудности не возникают.
Для того чтобы избежать опасности перегрева в камере Приора, стерилизуемые поверхности обводят невысоким, но горячим пламенем, направляя его в сторону от самой камеры.
