Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Многие охлаждающие жидкости имеют температуру, достаточную для замораживания клеток. Наиболее широко используется жидкий азот, имеющий точку кипения при —196°С. При такой температуре не происходит ни химических, ни физических изменений.
Жидкий азот имеет ряд преимуществ по сравнению с другими охлаждающими агентами. Он недорогой, легко доступен, не влияет на pH пробы и не оставляет следов при испарении.
ВЛИЯНИЕ ЗАМОРАЖИВАНИЯ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ
Когда клетки консервируют при минусовых температурах, необходимо создать такие условия, в которых они способны выжить и которые вызывали бы минимальные структурные повреждения. Судить о влиянии низких температур трудно, потому что клетки, явно поврежденные (о чем свидетельствует их деформация) часто сохраняют жизнеспособность, а клетки, которые выглядят хорошо, могут оказаться нежизнеспособными.
По отношению к клеткам нельзя применять критерии, которые применяют при оценке сохранности какого-либо другого биологического материала. При охлаждении клеток ниже О “С наблюдаются, как указывалось выше, следующие основные изменения: 1) образуются кристаллы льда; 2) исчезает вода; 3) увеличивается концентрация растворимых веществ в клетке. Эти изменения часто происходят одновременно.
Быстрое охлаждение может вызвать температурный шок, в результате которого клетки сильно повреждаются и гибнут. Лавлок [26] предполагает, что этот эффект обусловлен повреждением клеточных мембран, хотя истинная причина пока не ясна. Кроме того, одни клетки, по-видимому, более чувствительны к таким повреждениям, чем другие [27]. Индивидуальность клеток особенно проявляется при образовании кристаллов льда.
Если клетки охлаждают достаточно медленно, то они обезвоживаются, но не замерзают. При более быстром охлаждении, однако, клетки меньше обезвоживаются, но происходит замораживание внутри клетки. Увеличение скорости охлаждения приводит к образованию небольших кристаллов льда внутри клеток. Быстрое оттаивание необходимо для того, чтобы помешать превращению этих мелких кристаллов в крупные. Такой процесс, называемый рекристаллизацией [28—30], произойдет, если оттаивание осуществлять медленно. Более подробные сведения об изменениях, связанных с образованием льда в клетках при замораживании, можно найти в работе Мерримэна [31]. Мазур [32] дает возможное объяснение связи между размерами кристаллов льда и степенью повреждения клетки.
МЕТОДЫ ЗАМОРАЖИВАНИЯ И ОТТАИВАНИЯ
Имеется много опубликованных работ, посвященных именно этим аспектам хранения клеток при низких температурах. Некоторые точки зрения на эти вопросы противоречивы, тем не менее можно вывести некоторые общие правила, касающиеся техники замораживания живых клеток.
ЗАМОРАЖИВАНИЕ
Замораживание должно быть медленным, пока температура не снизится по крайней мере до —20 °С. Оптимальная скорость снижения температуры приблизительно 1 °С в минуту. Снижение температуры от —20 °С до температуры хранения (в жидком азоте эта температура составляет —196 °С) должно быть по возможности очень быстрым. Не следует замораживать большое количество клеток, чтобы теплообмен в пробе был быстрым и равномерным.
Среда, в которой суспендируют клетки, состоит из ростовой среды, но с более высоким, чем обычно, содержанием сыворотки, а также с добавлением либо глицерина, либо диметилсульфоксида. Для хранения клеток необходимо использовать проверенные и надежные аппараты. Колебания температуры в аппарате могут сильно повредить клетки. Такое осложнение возникает при работе с аппаратами устаревших моделей, в которых клетки охлаждают твердой двуокисью углерода. Использование жидкого азота позволяет избежать колебаний температуры.
Метод
Снижение температуры можно контролировать разными способами. Примером простого «самодельного» прибора, основанного на использовании охлаждающего действия испаряющегося жидкого азота, может служить прибор, предложенный Нагинтоном и Гривесом [33]. По тем же принципам действует технически более совершенный прибор, выпускаемый фирмой Union Carbide. Оба прибора требуют калибровки, но при умелом обращении они дают удовлетворительные результаты.
Помимо таких простых приборов, существуют также сложные электронные приборы. Один из них, впервые описанный Пеггом и др. [34], был применен для хранения замороженных клеток костного мозга. В дальнейшем выяснилось, что такие приборы можно использовать для разных клеток и другого биологического материала, особенно если требуется точно запрограммированная скорость понижения температуры.
Для хранения берут молодые культуры. Если клетки культивировали в монослое, то их снимают с поверхности стекла трипсином, промывают и суспендируют в среде для замораживания. Суспензию клеток определенной концентрации запаивают в ампулы. Подробно этот метод описан в работе Уосли и Мэя [35].
ОТТАИВАНИЕ
Этот процесс должен быть по возможности быстрым. Ампулы, взятые из жидкого азота, сразу же помещают в водяную баню при 40 °С. Как только клеточная суспензия полностью оттает, ее разводят предварительно подогретой ростовой средой. Оттаивание лучше всего проводить в закрытой бане. Ею может служить стакан из нержавеющей стали, покрытый металлической сеткой.
