Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
ну удобнее зажимать на столике микроскопа. Размеры самой камеры также несколько изменены, а именно: общий диаметр уменьшен до 23 мм, а диаметр столбика— до 17 мм; ширина и глубина кольцевого углубления увеличены до 3,0 и 3,6 мм соответственно; глубина 0,7 мм; диаметр боковых канальцев, которые идут под углом, уменьшен до 1,5 мм.
Такая модифицированная камера стерилизуется облучением; она предназначена для одноразового использования. С ней работают так же, как и с исходной моделью; мы, однако, не имеем собственного опыта использования этой камеры для постоянной перфузии.
Камера Уосли для микрокультивирования. Эта камера представляет собой ряды углублений, или лунок, штампованных в цельной пластине из пластика (рис. 5.8). Такая камера была предложена Такачи [31] для разработанного им метода микротитрования; Такачи и др. [32] использовали ее для количественной оценки связывания вируса гриппа с антителами. Сивер [33] впервые использовал множественные микрокамеры для культивирования клеток, которые применялись в тестах на подавление метаболизма. Конечную точку титрования определяли по цвету индикатора (фенолового красного), включенного в среду; микроскопическое исследование клеток не производили. Для титрования требовалась трехсуточная инкубация. Чтобы предотвратить испарение, содержимое каждой лунки покрывали тонким слоем минерального масла. Сулливан и Розенбаум [34] (опять-таки вирусологи) приспособили этот метод для однослойной культуры, так что изменения клеток можно было наблюдать в микроскоп. Пластины, которые применяли Такачи и Сивер, были сделаны из плексигласа, а лунки в них были коническими и полусферическими соответственно. Сулливан и Розенбаум использовали для культивирования клеток смачиваемый пластик, в котором были выштампованы углубления с плоским дном. Эти авторы также наносили поверх лунок слой минерального масла, и поэтому для изучения клеток приходилось пользоваться инвертированным микроскопом.
В настоящее время микрокамеры широко используются для культивирования клеток в вирусологической
Рис. 5.8. Камера Уосли.
А. Микрокамера для культивирования из толстого пластика (тип IS-FB-96; масштаб 2/3 : 1). Б. Более тонкая пластинка, из которой вырезают пробки (тип
FB-48; масштаб 2/3 : 1).
практике и для многих других целей, поэтому выпускаются пластины с самыми разнообразными углублениями. Уосли [35] нашел простой способ герметизации лунок; такие пластины можно переворачивать и рассматривать клетки, прикрепившиеся к дну лунок, в обычный
микроскоп. Плоскодонные камеры, [вырезанные из пластин, выштампованных из тонкого пластика, были использованы для герметизации лунок в пластинах из более толстого пластика. Такие пластины из нетоксичного пластика выпускает фирма Linbro (Linbro Co. of New-haven, Connecticut, USA); они предназначены для одноразового пользования. Тонкие пластины, из которых вырезают «пробки», имеют шифр FB-48, а толстые, которые служат камерами,—IS-FB-96 (рис. 5.8). Внутренний диаметр дна лунки примерно 5,5 мм, а объем каждой камеры с пробкой около 0,2 мл.
Микрокамеры, которые используют кж пробки, вырезают ножницами (вместе с окружающей плоской частью пластины, которую затем подрезают, оста(вляя вокруг кольцевой ободок шириной в несколько миллиметров. Ободок обеспечивает жесткость «пробки» и позволяет захватывать ее пинцетом. Пробку помещают в отверстие лунки и прижимают пинцетом. Особого давления для герметичности не требуется и при необходимости пробку лепко извлечь. Чтобы между ободками соседних пробок оставался зазор, в каждом ряду используют лунки через одну, так чтобы напротив используемых лунок одного ряда были пустые лунки соседнего. Таким образом, в пластине, содержащей 8 рядов по 12 лунок в каждом, одновременно используется 48 лунок.
Перед употреблением пластины с камерами и пробки погружают на 30 мин в абсолютный спирт, разбавленный бидистиллированной водой (до 70%), затем четырежды промывают бидистиллированной водой, высушивают на воздухе при комнатной температуре в стерильном контейнере и облучают ультрафиолетом в течение 30 мин. Вырезают и стерилизуют сразу много пробок, так что, если при работе камеру придется открыть, ее следует снова закрыть стерильной пробкой. Все подобные операции следует выполнять в настольном боксе и извлекать пластины из стерильного контейнера только для микроскопического исследования.
В лунке должно быть столько жидкости, чтобы она не вытекала, когда вставляют пробку; вместе с тем после вставления в камере должен оставаться лишь очень
небольшой пузырек воздуха. Выполнить эти требования позволяет пипетка на 0,2 мл. При избытке воздуха на внутренней поверхности пробки во время инкубации конденсируются пары воды в виде мельчайших капелек, которые мешают освещению, когда пластину переворачивают для микроскопического исследования. Кроме того, в перевернутой пластине большой пузырек поднимается кверху, в результате чего изменяется коэффициент преломления среды и искажается изображение.
По своим оптическим качествам такие камеры лучше пробирок, но из-за глубины (6,5 мм) и толщины дна лунок (1,5 мм) они, естественно, уступают камерам Тре-вана — Робертса, Приора, Круикшенка и Стерилина. Тем не менее, если их правильно заполнять и использовать длиннофокусный конденсор, с ними можно работать при увеличениях порядка 20 X.
