Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
[2] необходимы трехмерные кристаллы. Метод структурного анализа белков с
использованием реконструированных мембран находится пока еще в
зачаточном' состоянии. Двумерные кристаллы на основе реконструированных
мембран удалось получить только для бактериородопсина (см. обзор [114]) и
для светособирающих комплексов хлорофилл а/Ь [115]. Предварительные
исследования, проведенные в лаборатории Страуда, показали, что можно
вырастить трехмерные микрокристаллы реконструированного ацетилхолинового
рецептора (S. Choe, личное сообщение). Ценность использования
реконструированных мембран в исследованиях структуры белков очевидна,
однако осуществить успешную кристаллизацию (двумерную либо трехмерную)
нелегко, поскольку она зависит от многих факторов: типа и концентрации
детергента, присутствия небольших амфифильных молекул (необходимых для
заполнения пустот в кристаллической решетке) и фазового состояния
мембранных липидов. Встраивание очищенного белка
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков 247
в липид определенного типа не только упрощает исследуемую систему, но и
позволяет изменять, вероятно, наиболее важные для мембранных белков
условия, а именно - свойства границы раздела фаз. Другое преимущество
использования реконструкции для кристаллизации мембранных белков состоит
в том, что мембраны, которые в нативном состоянии образуют везикулы, при
низком отношении липид/белок часто формируют незамкнутые пластинки [116J.
Реконструкция изображения упрощается, когда имеется только один слой
упорядоченного белка.
Ниже описан метод, который применил Ли [115J, чтобы получить
высокоупорядоченные решетки реконструированного мембранного белка.
Светособирающие комплексы хлорофилла а/b выделяли из сеянцев гороха в
1,5°/о-ном (о/о) тритоне Х-100 и включали их в азолектиновые везикулы
методом замораживания- оттаивания [65]. Избыток тритона Х-100 удаляли
адсорбцией на смоле биобидс SM-2 и индуцировали образование решетки
инкубацией мембран с 2 мМ MgCl2. Мембраны фракционировали в градиенте
сахарозы (0-40%, в/о) в буфере, содержащем 0,03% тритона Х-100. Наличие
небольшого количества детергента облегчает удаление избытка липида и
способствует ¦включению контрастирующего реагента в липидную фазу.
Реконструированные мембраны центрифугировали при 95000 g в течение 20 ч,
сахарозу удаляли диализом или снижали ее концентрацию разбавлением и
выделяли двумерные кристаллы или ¦везикулы центрифугированием. Для
электронно-микроскопического исследования препарат контрастировали 2%-ным
(в/о) раствором уранилацетата. Реконструкция изображения по электронной
микрофотографии дала трехмерную структуру белков с разрешением 30 А.
6. Заключительные замечания
Несмотря на большие успехи, достигнутые мембранной биологией на всех
направлениях, по-прежнему остается справедливым (если не полностью, то по
крайней мере частично) замечание Рэкера [18], что "в области
реконструкции мы не имеем никакой общей руководящей идеи, которая могла
бы пригодиться при решении вновь возникающих задач. Мы не можем ни
рекомендовать какой-либо универсальный детергент, подходящий для
солюбилизации любых мембранных белков, ни предложить такую методику
реконструкции, которая оказалась бы успешной для всех белков". Поэтому
данная глава написана с целью высветить те основные принципы и
практические подходы, которые можно было бы применить практически в любой
схеме солюбилизации и реконструкции. Кроме того, в ней еде-
248
Глава 5
лана попытка привлечь внимание читателя к разнообразным возможностям
применения реконструированных систем в мембранной биологии.
Литература
1. Singer S. Nicolson G. L. (1972). Science, 175, 720.
2. Michel H. (1983). Trends Biochem. Sci., 8, 56.
3. Bennett A. B., O'Neill S. D., Spanswick R. M. (1984). Plant Physiol.,
74, 538.
4. Hjelmeland L. М., Chrambach A. (1984). In: Methods in Enzymology.
Jakoby W. B. (ed.), Academic Press, New York and London, Vol. 104, p.
305.
5. Klausner R. D., Van Renswoude J., Blumenthal R., Rivnay B. (1984). In:
Receptor Biochemistry and Methodology, Vol. 3. Venter J. C" Harrison L.
C. (eds.), Alan R. Liss, New York, p. 209.
6. Lichtenberg D., Robson R. J., Dennis E. A. (1983). Biochim. Biophys.
Acta, 737, 285.
7. Helenius A., Simons K. (1975). Biochim. Biophys. Acta, 415, 29.
8. Reynolds J. A. (1982). In: Lipid - Protein Interactions. Jost P. C.,
Griffith О. H. (eds.), Wiley, New York, Vol. 2, p. 193.
9. Andersen J. P., LeMaire М., Kragh-Hansen U" Champeil P., Moller J. V.
(1983). Eur. J. Biochem., 134, 205.
10. Earnest J. P., Stroud R. М., McNamee M. G. (1986). Biophys. J., 49,
522a.
11. Jackson M. L" Litman B. J. (1985) Biochim. Biophys. Acta, 812, 369.
12. Roux М., Champeil P. (1984). FEBS Lett., 171, 169.
13. Tietz N. IV. ed. (1976). Fundamentals of Clinical Chemistry.
Saunders, Philadelphia.
14. Akiyama T" Takagi S., Sankawa U., Inari S., Saito H. (1980).
Biochemistry, 19, 1904.
15. Siakatos A. N., Rouser G. (1965). J. Am. Oil Soc., 42, 913.
