Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
рецептор в высокоаффинное состояние [95], которое можно отличить от
состояния связывания покоящегося рецептора, измеряя скорость связывания
токсина. Переход из низкоаффинного состояния в высокоаффинное характерен
для ацетилхолинового рецептора, функционирующего в мембранном окружении,
и является необходимой предпосылкой активации ионного канала. Таким
образом, анализируя связывание, можно эффективно оценивать успешность
проведения реконструкции. Интересно, что в случае солюбилизированного
ацетилхолинового рецептора переход из низкоаффинного состояния в
высокоаффинное не наблюдается, поэтому связывание следует определять в
отсутствие детергента. Отделение мембран от несвязавшегося токсина можно
проводить центрифугированием, однако метод фильтрования более прост и
более пригоден для анализа большого числа образцов. Данные по
конкурентному связыванию довольно хорошо согласуются с результатами,
полученными при прямых измерениях связывания радиоактивно меченного
ацетилхолина и карбамилхолина [42].
При прямых измерениях связывания низкомолекулярных активирующих лигандов
с использованием меченных тритием ацетилхолина и карбамилхолина
необходимо строго соблюдать условия фильтрования, чтобы избежать разброса
данных из-за быстрой диссоциации обратимо связанного лиганда. С этой
целью рекомендовано использовать стекловолокнистые фильтры (ватман GF/F)
и точно выдерживать время фильтрования под вакуумом [42]. Поправку на
захват изотопа и неспецифическое связывание определяли после
предварительной инкубации образцов с избытком немеченого токсина.
Серьезную проблему при определении связывания представлял разброс по
удельной радиоактивности различных партий меченого лиганда. Истинные
значения были получены после очистки ацетилхолина электрофорезом и
разбавления его немеченым лигандом перед измерением удельной
радиоактивности. Во всех случаях измеренные величины значительно
отличались от тех, которые были указаны поставщиком [42].
Другой подход, который оказался успешным в ряде случаев, основан на
введении в белок спиновой или флуоресцентной мет-
236
Глава 5
Таблица 5.10. Исследование связывания токсина с ацетилхолиновым ре цеп
тором
Принцип
Ацетилхолиновый рецептор, солюбилизированный детергентом, инкубируют с
избытком радиоактивно меченного а-бунгаротоксина при 4 °С в течение 30-
60 мин для того, чтобы занять все доступные места связывания. Комплекс
рецептор-токсин отделяют от несвязавшегося токсина фильтрованием смеси
через ДЭАЭ-фильтры. Токсин заряжен положительно и потому не связывается с
фильтром, тогда как отрицательно заряженный комплекс адсорбируется на
фильтре (при низкой ионной силе).
Буферы
NMT-100: 100 мМ NaCI NMT-10: 10 мМ NaCI
10 мМ MOPS 10 мМ MOPS
0,2с/о-ный тритон Х-100 0,2%-ный тритон Х-100
pH 7,4 pH 7,4
Токсины
Радиоактивно меченный токсин: [|251]-а-бунгаротокснн (2-4 мкМ) в буфере,
содержащем 5 мМ фосфат натрия, pH 6,5, и 1 мг/мл БСА; (1-2) ¦ 105
расп./мин на 1 пмоль. Поставляется фирмами NEN и Amersham.
Немеченый токсин: 20 мкМ а-бунгаротоксин в буфере NMT-100.
Методика анализа
1. Разбавляют ацетилхолиновый рецептор буфером NMT-100 так, чтобы в 50
мкл содержалось 2-3 пмоль центров связывания (40-60 нМ). Для анализа
каждого образца требуется четыре аликвоты по 50 мкл.
2. Вносят аликвоты по 50 мкл в четыре пластиковые пробирки (емкостью 10-
15 мл). Две пробирки служат контролем (их содержимое обрабатывают
немеченым токсином для введения поправки на неспецифчческое связывание),
а две другие используются для определения полного связывания.
3. В контрольные пробирки добавляют по 15 мкл раствора немеченого
токсина, а в две другие - по 15 мкл буфера NMT-100. Оставляют все
пробирки при комнатной температуре на 20 мин. Для каждого аналитического
комплекта готовят еще две фоновые пробирки, чтобы определить
неспецифпческое связывание токсина с фильтрами в отсутствие
ацетилхолинового рецептора. В каждую из этих пробирок вносят по 65 мкл
буфера NMT-100.
4. Разбавляют радиоактивно меченный токсин буфером NMT-100 до
концентрации 150 нМ. Для каждого образца требуется 4X50 мкл. Еще 200 мкл
необходимы в качестве внутреннего стандарта для определения
неспецифического связывания на фильтре.
5. Добавляют по 50 мкл разбавленного раствора радиоактивно меченного
токсина в каждую пробирку. Инкубируют 45 мин при комнатной температуре.
6. Помещают по два фильтра ватман DE-81 на каждый держатель вакуумной
фильтровальной установки. Промывают фильтры 4 мл буфера NMT-10 при низком
вакууме. (Хорошо зарекомендовала себя установка Hoefer с фильтрами
диаметром 24 мм, но в принципе годится любая фильтровальная установка.)
7. Разбавляют каждый образец 5 мл буфера NMT-10 и сразу же наносят его на
фильтр, подводя фильтрование при слабом отсасывании. Наполняют пробирку
буфером NMT-10 и промывают фильтр. Повторяют промывку. Снимают почти
сухие фильтры пинцетом и помещают их в пластиковые пробирки.
? Определяют радиоактивность сухих фильтров на гамма-счетчике в условиях,
