Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
и лигандом от свободного лиганда [106].
4.1.3. Кальциевые каналы
При очистке потенциалзависимых кальциевых каналов из скелетной мышцы
Куртис и Каттерол [107] столкнулись с двумя серьезными проблемами в
дополнение к трудностям, связанным с низкой концентрацией этих каналов в
ткани. Во-пер-
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
239
вых, поскольку активация канала происходит при изменении потенциала, для
регистрации функциональной активности требуется интактная мембрана, на
которой может быть создан стабильный трансмембранный потенциал. Как мы
покажем в следующем разделе, трудно разрабатывать методику очистки
мембранного белка, когда при рутинном анализе имеются такие жесткие
ограничения условий реконструкции. Во-вторых, связывание специфических
антагонистов, таких, как [3Н]-нитрен-дипин, после солюбилизации белка в
детергенте (дигитонине) не удается зарегистрировать из-за очень сильного
неспецифического связывания лиганда с детергентными мицеллами. Эту
проблему удалось частично решить путем предварительной инкубации
очищенных мембран с [3Н]-нитрендипином с последующим отмыванием
неспецифически связавшейся метки и солюбилизацией и очисткой комплекса
канал - лиганд. Выход меченого белка контролировали на всех стадиях
очистки и удельную активность корректировали с учетом медленной
диссоциации лиганда и комплекса.
4.2. Методы регистрации транспорта и проницаемости
Основная ценность методов реконструкции состоит в том, что они дают
возможность в контролируемых условиях регистрировать транспортные функции
мембраны или ее проницаемость. В тех случаях, когда транспорт требует
наличия ионного градиента или мембранного потенциала, мембраны должны
быть непроницаемыми, чтобы создать изолированные объемы, необходимые для
осуществления векторных процессов. Один из самых изящных и принципиально
важных экспериментов по реконструкции был проведен Рэкером и Стокениусом
[108]. Они включили в одни и те же липидные везикулы бактериородоп-син -
светозависимый протонный насос, выделенный из пурпурных мембран клеток
Halobacterium halobium, и АТРазный комплекс из митохондрий. Было
показано, что свет может запускать синтез АТР из ADP в реконструированных
везикулах. Поскольку единственная функциональная связь между этими двумя
белками заключалась в создании протонного градиента и обусловленного им
мембранного потенциала, этот эксперимент наглядно доказал значение
протондвижущей силы в запуске синтеза АТР.
Благодаря возможности измерять захват или высвобождение ионов, а также
молекул из замкнутых реконструированных везикул последние широко
используются для характеристики тех условий, которые абсолютно необходимы
для функционирования ионных каналов или транспортных систем.
240
Глава 5
4.2.1. Ацетилхолиновый рецептор
Хорошо известно, что в случае ацетилхолинового рецептора связывание
активирующих лигандов, таких, как ацетилхолин, сопровождается открыванием
катионспецифичного ионного канала. Длительный контакт ацетилхолинового
рецептора с активирующим лигандом приводит к обратимой инактивации
канала. Этот процесс обычно называют десенситизацией рецептора. Многие
ключевые вопросы, связанные с различными путями активации и инактивации
рецептора, были выяснены на основании электрофизиологических исследований
интактных рецепторов и изучения ионных потоков, проведенного на
изолированных мембранах (см. обзоры [40, 57]). Реконструированные
мембраны, содержащие очищенный ацетилхолиновый рецептор, дают возможность
определить, сохраняет ли выделенный белок те функциональные
характеристики, которые приписываются самому рецептору. Они позволяют
также получить данные, более пригодные для количественного описания
механизма регуляции ионной проницаемости ацетилхолинового рецептора. На
рис. 5.5, 5.6 и 5.7 схематически представлены две методики регистрации
ионной проницаемости, которые используются в настоящее время для изучения
функциональной активности мембран, содержащих ацетилхолиновый рецептор, а
в табл. 5.11 постадийно описан простой метод регистрации захвата ионов
везикулами, который обычно используется для определения активности
ацетилхолинового рецептора в реконструированных мембранах.
Первый метод, представленный на рис. 5.5, основан на стимулируемом
агонистом захвате радиоактивно меченных ионов везикулами. Связывание
агониста с рецептором открывает ионный канал, благодаря чему ионы
проходят через мембрану до достижения равновесного распределения между
везикулами и средой. Ионы, не вошедшие внутрь везикул, отделяют от
захваченных ими ионов с помощью катнонообменной колонки. Везикулы,
содержащие захваченные ионы, можно также выделить из инкубационной смеси
фильтрацией или центрифугированием, однако метод ионного обмена является
более быстрым и, кроме того, позволяет избежать потери везикул малого
размера, например за счет их прохождения через поры фильтра. В
соответствии со схемой эксперимента (рис. 5.5) для остановки процесса
