Биологические мембраны - Финдлея Дж.Б.
ISBN 5-03-001317-2
Скачать (прямая ссылка):
оптимальных для детектирования 1251.
9 Для приготовления внутреннего стандарта берут два фильтра и наносят
прямо на них по 50 мкл раствора меченого токсина.
Солюбилизация и реконструкция мембранных белков
237
С помощью внутреннего стандарта можно рассчитать удельную радиоактивность
токсина в имп./мин на I пмоль токсина. Число пнкомолей связавшегося
токсина в каждом образце можно определить путем вычитания числа импульсов
за счет неспецифического связывания из суммарного числа импульсов.
Специфичность связывания в данном случае настолько высока, что степень
иеспеци-фического связывания близка к нулю даже для очень разбавленных
препаратов рецептора. Контрольные пробирки и пробирки для определения
фона дают фактически одинаковые значения. На практике иет необходимости
проводить по два контрольных определения для каждого образца. Обычно
берется только один набор контрольных образцов для всего комплекта
образцов, анализируемых за один прием.
ки. Если метка чувствительна к связыванию белка с лигандом, то это дает
возможность непрерывно регистрировать процесс связывания во времени.
Шанже и др. [96] использовали флуоресцентные аналоги ацетилхолина для
измерения его связывания с ацетилхолиновым рецептором как в нативных, так
и реконструированных мембранах с очень хорошим временным разрешением..
Они обнаружили переход из низкоаффинного состояния в высокоаффинное и
получили данные о том, что ннзкоаф-финное состояние отвечает
неактивированному ацетилхолиново-му рецептору. Рафтери и др. [97]
использовали различные метки, ковалентно связанные с ацетилхолиновым
рецептором, как косвенные датчики на связывание ацетилхолина. Они
показали, что новые места связывания по своим характеристикам отличаются
от двух известных высокоаффинных центров.
4.1.2. (З-Адренэргический рецептор
Регуляция активности аденилатциклазы при участии |3-ад-ренэргического
рецептора происходит благодаря взаимодействию в мембране трех разных
белков: самого рецептора, Gs-белка и аденилатциклазы. Gs-белок
представляет собой олигомерный белок, который связывает GTP (и его
аналоги) и стимулирует аденилатциклазу. Негидролизуемые аналоги GTP
вызывают стойкую активацию аденилатциклазы. [РАдренэргический рецептор
(как и другие рецепторы гормонов) влияет на активность Gs-белка и через
него регулирует активность аденилатциклазы [98, 99]. Методы
солюбилизации, очистки и реконструкции белков сыграли решающую роль в
идентификации и характеристике основных компонентов этой сложной системы
[93]. Общая методика включает по меньшей мере пять функциональных тестов:
1) связывание лигандов, таких, как [3Н]-дигидроальпренолол (агонист) или
[1251]-иодгидроксибензилпиндолол (антагонист), с [Радренэргическим
рецептором;
2) связывание GTP или его негидролизуемого аналога с Gs-бедком;
3) активация Gs-белка, определяемая по его способности стимулировать
аденилатциклазную активность;
238
Глава 5
4) GTP-азная активность Gs-белка;
5) сама аденилатциклазная активность.
Ряд исследователей изучали различные проблемы регуляции аденилатциклазы
как в нефракционированной ферментной смеси, так и после ее разделения
[100-104]. Росс и др. [100, 101] сконцентрировали свои усилия на изучении
взаимодействия между p-адренэргическим рецептором из эритроцитов индейки
с Gs-белком из печени кролика, приводящего к активации Gs-белка.
Специальные эксперименты, проведенные с плазматическими мембранами клеток
лимфомы, которые не содержат Gs-белка, показали, что экзогенный Gs-белок,
находящийся в активированном состоянии (т. е. содержащий связанный GTP),
способен стимулировать аденилатциклазу [105]. Задача состояла в том,
чтобы по отдельности очистить рецептор и Gs-белок и затем встроить их в
одни и те же липидные везикулы. Для удаления детергентов использовали
гель-фильтрацию на сефа-дексе G-50. Поскольку рецептор и Gs-белок были
очищены разными методами и в полученные растворы были включены
дополнительные липиды, окончательная солюбилизирующая смесь имела очень
сложный состав и содержала четыре детергента: дигитонин, луброл,
дезоксихолат и холат.
Детальный анализ этой работы позволяет увидеть некоторые проблемы,
типичные для исследований мембранных белков. Например, луброл 12А9 -
детергент, использованный для солюбилизации Gs-белка - ингибирует
ОТРазную активность, но не влияет на связывание GTP и его аналогов [101].
На основании результатов предыдущих исследований (проведенных с
использованием луброла) был сделан ошибочный вывод, что ОТРазная
активность не имеет отношения к Gs-белку. В реконструированной системе
после удаления детергента эта активность восстанавливается. Солюбилизация
детергентом также приводит к нарушению связывания антагонистов (но не
[3Н]-дигидроальпренолола) с рецептором. Полное восстановление связывающей
активности происходит в реконструированной системе. Для определения
связывания низкомолекулярных лигандов были использованы стеклянные
фильтры (ватман GF/F), позволяющие быстро отделить комплекс между белком
