Трансформированная клетка - Эш Б.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Различия значений времени релаксации протонов воды, зарегистрированные с помощью метода ЯМР в культурах эпителиальных клеток, полученных из нормальной ткани молочной железы, были более четкими (р<С 0,001), чем в клетках ткани, находящейся в предопухолевом состоянии, и малигнизированной ткани.
Ткани молочной железы получали по ранее описанному методу от самок мышей линии ВALB/c Crgl. Ткани брали в асептических условиях, 3—4 раза промывали в сбалансированном солевом растворе Дюльбекко, забуференном HEPES (DBSS) (pH 7,3), и разрезали на кусочки (1—2 мм3). Кусочки инкубировали в растворе коллагеназы (тип III, Worthington Enzymes, Freehold, New Jersey). Как описано в работе Asch и Medina (1978), клетки отмывали, пересаживали (Fal-
20 5-1329
289
con) и инкубировали при 37 °С в атмосфере 92,5 % воздуха с 7,5 % С02 в модифицированной Дюльбекко среде Игла (DMEM), содержащей 13 % эмбриональной бычьей сыворотки (Reheis) и 5 мг/мл инсуг лина, D-валин в ней был заменен L-валином для подавления роста фибробластов (Gilbert, Migean, 1975). Через 5 сут клетки собирали для измерений их ЯМР. Приблизительно 90—95 % клеток по своим морфологическим характеристикам относились к эпителиальным (рисунок, см. вклейку). Клетки каждого типа первичных культур перевивали в жировую клетчатку молочной железы самки 3-недельных сингенных мышей, а затем через 8 нед. после гистологического исследования определяли нормальную, предопухолевую или опухолевую ткань в соответствии с их морфологией (White et al., 1978).
Три линии клеток опухолей молочной железы мышей (ESSD/BALB CL3, MTV-L/BALB DL2, DMBA/BALB CL2) представлены доктором Butel из отдела вирусологии Baylor College of Medicine. Происхождение и характеристики роста in vivo и in vitro этих линий детально описаны в работе Butel и сотрудников (1977). Клеточные линии росли в DMEM с 10 % эмбриональной бычьей сыворотки, 15 мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл и 100 ед/мл стрептомицина и пенициллина, при 37 °С и атмосфере, состоящей из 90 % воздуха и 10 % С02.
Первичные культуры и стабильные линии раковых клеток были закодированы и определены только на основании данных Тх и Т2. Для этого клетки отделяли от поверхности пластиковых флаконов тефлоновым скреппером. Проверка на наличие повреждений в клетках проводилась с помощью их окрашивания трипановым синим и показала отсутствие каких-либо повреждений после этой процедуры. Суспензии клеток в DMEM центрифугировали в условиях комнатной температуры (25 °С) в течение 40 мин, при ускорении 1200 в ампулах для исследований ЯМР. Супернатант удаляли, а ампулу вытирали хлопковой тканью. Остаточный межклеточный объем составлял около 10 %. После измерения ЯМР клеточный осадок высушивали до постоянной массы при 105 °С для определения отношения массы Н20 к массе твердого вещества (или % Н20). Закрытые клеточные осадки измеряли при 30 MHz и 25 °С на спектрометре ЯМР Bruker SXP. Тг определяли из 180°-т-90° импульсных последовательностей, а Т2 — методом спин-эха по Carr-Purcell с коррекцией фазы по Meiboom-Gill.
Результаты экспериментов, проведенных на тканях (Hazlewood et al., 1972), показали, что значения Тг и Т2 отражают различное состояние молочной железы мышей (см. табл. 5). Более того, после удаления жира, соединительной ткани, сосудистых элементов и участков некроза, используя первичные культуры, удалось увеличить достоверность различий по этим показателям ЯМР (р < 0,001) нормальных, предопухолевых и опухолевых эпителиальных клеток молочной железы (см. рисунок). Как значения 7\, так и значения Т2 для опухолевых клеток существенно отличались от таковых нормальных (Р < 0,001). Эти различия не могут рассматриваться как различия клеточной гидратации (см. табл. 6). Значение времени релаксации для клеток, взятых из ткани, находящейся в предопухолевом состоянии, занимает промежуточное положение между значениями этого
290
Таблица в. Ткани и первичные клеточные культуры молочной железы* время релаксации воды, измеренное с помощью ЯМР, в нормальных, предопухолевых
и опухолевых клетках
Образец Целая ткань Первичные клеточные культуры 1
Т, (мс)2 Г8 (мс) Tt (мс) Т, (мс) | н,0 <%)
Нормальная ткань 380 ±41 39±2 916 ±24 158±б 90,8±0,4
молочной желе
зы беременных
мышей
Гиперпластические 451 ±21 53±1 1029±24 187 ±7 90,0±0,5
альвеолярные (р <0,005)в (р < 0,01) (Р > 0,7)
узлы (D2-HAN)
Аденокарцинома 920±47 01±8 1155±42 206±8 91,4 ±0,2
молочной желе (р < 0,001) (р < 0,001) (р > 0,3)
зы
(D2)
Примечан и я; *п — 15 образцам каждого типа или всего 45 образцов; время релаксации и % Н20 показаны как средние значения ± стандартное отклонение; 3р — степень достоверности различий между нормальной тканью и изучаемой, которая определялась с помощью t- критерия Стьюдента.
