Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
4. Освобождаются от солей на колонке (0,9X15 см) с сефадексом G-25, уравновешенной 0,1 М Na-фосфатным буфером, pH 0,6 с 5 мМ ЭДТА.
5. Разделение F(ab')2- и Fab-фрагментов проводят гельфильтрацией на колонке (0,9X30 см) с ультрагелем АсА-22, уравновешенной тем же буфером.
6. Концентрацию Fab-фрагмента рассчитывают, используя коэффициент молярного поглощения ?Pab = 1,48 г—Ьд-см-1.
§ 4. Тестирование антисывороток
Антисыворотки, полученные даже от одного животного, значительно различаются по своей способности связывать антиген. Для сравнительной характеристики и оценки качества антисывороток проводят их тестирование, которое позволяет решить следующие две важные задачи: во-первых, произвести отбор именно тех сывороток, которые по своим свойствам (специфичности, аффинности, авидности и концентрации присутствующих в них специфических антител) удовлетворяют требованиям иммунохимического. анализа; во-вторых, осуществить стандартизацию антисывороток при их промышленном .производстве для иммуноферментных наборов.
Первичный отбор антисывороток проводят на основании нахождения их титра, который представляет собой интегральный параметр, характеризующий взаимодействие с антигеном. Более детальные сведения о сыворотке получают, определяя аффинность и концентрацию антител. Следующий этап — это установление антигенной специфичности антител, т. е. возможности взаимодействовать со структурно сходными антигенами.
Принципиальное различие этих этапов заключается в следующем: при определении титра исследуют связывание выбранной концентрации антигена при различных разведениях .антисыворотки. При определении аффинности и концентрации антител исследуют связывание антисыворотки (в определенном разведении) с различными концентрациями меченого антигена. При изучении специфичности антисывороток в соответствующем разведении и при постоянной концентрации меченого антигена добавляют различные концентрации перекрестно реагирующего антигена.
Во всех случаях используют концентрации антигена либо близкие к минимально детектируемым в данном виде анализа, либо в том диапазоне, который соответствует их концентрации в Образце.
Определение титра антисыворотки. Титр — это эффективная величина, характеризующая связывающую способность антител, за~ висящая от их концентрации и аффинности. Абсолютное значение титра также зависит от метода и условий проведения эксперимента (температуры, времени, pH и т. д.) и от начальной концентрации свободного антигена.
Количественно титр находят как предельное разведение сыво-ротки, при котором еще наблюдается положительный регистри-
руемый данным методом эффект взаимодействия антисыворотки с антигеном. Например, если титр устанавливают методом преципитации свободного антигена в геле и для первой сыворотки образование преципитата наблюдается при разведении в 2т раза, а для другой — в 2" раз (т>п), то титр первой сыворотки равен 2т, а второй — 2", причем вторая антисыворотка менее активная, чем первая. Иногда оперируют понятием «50%-ный титр», подразумевая под этим, соответственно, разведение сыворотки, вызывающее 50%-ное связывание антигена. «Рабочим титром» называют то начальное разведение сыворотки, которое используют непосредственно в эксперименте.
Таблица 5.2. Схема тестирования сывороток
Этап Условия Цель
исследоваиия
Титр [Аг *] ---постоянна Отбор высокоактивных иммун
Аффинность [Ат] ---варьирует ных аитисывороток, определение
Специфичность [Ат] --- постоянна конечного и рабочего титра
(рабочий титр) Оценка аффинности и концент
[Аг *] --- варьирует рации фракции высокоаффиниых
[Ат] --- постоянна антител
[Ari*] --- постоянна Определение специфичности ан
[Аг2] --- варьирует тител
(перекрестный)
где [Ат], [Аг *] и [Аг2] — соответственно концентрации антител, меченого антигена и иерекрестио реагирующего антигена
Титр антисыворотки сильно зависит от концентрации антигена, используемого для тестирования и от способа его определения. Например, одна и та же сыворотка может иметь титр 100 в тесте иммунопреципитации и 100 000 в тесте иммуноферментного анализа. Поэтому при тестировании сыворотки и определении титра лучше всего применять тот же метод, что и при анализе, а концентрацию антигена выбирать близкую к минимальной в том диапазоне, который выбран для анализа. Кроме того, следует учитывать, что в иммуноферментном анализе используют как гомогенные, так и гетерогенные методы определения концентрации антигена, которые могут сильно отличаться по структуре образующихся иммунных комплексов. В частности, в твердофазных методах вероятность образования циклических комплексов антиген — антитело значительно меньше, чем в гомогенных, а следовательно, и Наблюдаемая аффинность антител в обеих системах будет разная.
