Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Ar-J-Ат^ АгАт. ;
Обозначим равновесную концентрацию связанных антител как Вр, а концентрацию свободного антигена как Fj,, тогда можно записать следующее выражение (известное как уравнение Клотца):
_И|к = _Ь- + 1; (5.1)
В р Гр
Яр = 1Ат]0 —{Ат]; (5.2)
Fp=[Ar]0-5p. (5.3)
Если концентрации антител [Ат] 0 и [Ат] определять методом непрямого твердофазного ИФА, то при определенных условиях проведения эксперимента .будет выполняться соотношение [Ат]/ [Ат]о=Л/Ло, где А и А0 — значёния оптических плотностей, регистрируемых в ИФА, соответствующие концентрациям антител [Ат] и [Ат]0. Уравнение Клотца при этом условии может быть приведено к виду
---1 j-------------------К*----------. (5.4)
ГА -I п . А) -А К }
[Аг]0 - [Ат]0------ '
0 •
Таким образом, для определения Кл описанным выше методом необходимо знание начальной концентрации антител [Ат] о. Однако практически нахождение Кл проводится в иммунных сыворотках, или асцитах, где точная концентрация антител [-Ат]0 неизвестна. Если проводить реакцию комплексообразования в избытке антигена, то количество связавшегося антигена незначительно по сравнению с исходным и его концентрация после установления в системе равновесия будет близка к исходной т е. [Ar]0».Fp. Если эксперимент проводится так, что выполняется условие [Аг] о >10[Ат] о, то
[Ат]0-4^-«;[Аг10,- - (5.5)
тогда уравнение Клотца преобразуется к виду
| ] К*
Аа-А
[Аг1о
Если представить экспериментальные данные в координатах Ао/(Аа—Л)-^1/[Аг]0, то по тангенсу угла наклона прямой можно рассчитать Кл.
Рис. 20. Определение константы диссоциации (Кл) комплекса пероксидаза — антитела к пероксидазе в координатах Клотца:
кривые 1 я 2 соответствуют значениям К(j 1,1 • 10-9 и 2,2 • 10-9 М
Рис. 21. Кинетика связывания моноклональных антител с инсулином, адсорбированным иа полистирольном планшете для ИФА из раствора концентрации 1 мкг/мл. Комплекс инсулин — антитело выявлен меченными пероксидазой антимышиными IgG:
по оси ордииат ¦— оптическая плотность А при 405 им продукта пероксидазиого окисления ABTS перекисью водорода
Таким образом, для практического осуществления' описанного метода необходимо, прежде всего, установить наличие линейной зависимости между концентрацией определяемых непрямым методом ИФА антител и регистрируемым значением оптической плотности. Для этого готовят серии разведений исследуемой иммунной сыворотки и изучают их связывание в непрямом методе ИФА. Обычно эти зависимости имеют, вид кривых с насыщением. Для проведения эксперимента выбираются разведения антисыворотки, лежащие в линейном диапазоне кривой. Для установления равновесной константы диссоциации комплекса Аг-Ат концентрацию антигена варьируют в диапазоне от 10~6 до 10-8 М. На рис. 20 приведен график для определения Кл комплекса ПХ-Ат. Однако вычисленные этим методом значения констант диссоциации комплекса Ат- Аг являются эффективными, поскольку при выборе уравнения не учитывается влияние взаимодействия антител с антигеном, сорбированным на твердой фазе, на равновесие в растворе.
Экспериментально контроль влияния иммобилизованного антигена на равновесие в реакции Аг—Ат в растворе осуществляется
сравнением сигналов, полученных на стадии твердофазного ИФА в двух соседних рядах лунок. Для этого содержимое лунок одного ряда переносится во второй свободный, обработанный аналогично первому, после чего сравнивают значения сигналов. Если наблюдаемые различия не превышают 10% (что обычно достигается при проведении измерения в кинетическом режиме через 5— 15 мин), то можно полагать, что влияние иммобилизованного антигена на равновесия Аг—Ат в растворе незначительно.
Более точная оценка общего случая с учетом влияния иммобилизованного антигена может быть дана в рамках модели связывания лиганда с несколькими независимыми центрами связывания:
tt П
Ar-f-^ (на Носителе) > (5-7)
i=\ <=1
Аг-\-кт^±В (в растворе) (5.8)
Если К* — константа связывания антител с иммобилизованным центром связывания (Аг), а [Ат*]г- — концентрация различных субпопуляций антител, связывающихся с иммобилизованным антигеном, то нетрудно показать, что в этом случае окончательное выражение уравнение Клотца будет иметь вид
(5-9)
П
Обозначим о+Цк* ДАт*]0;) как С. Параметр С для реакций ряда /= 1
антигенов был найден экспериментально, значение его не превышает 2—2,5. При этом оценка С получена в предположении, что реакция антител с иммобилизованным антигеном достигает равновесия. Кинетика этого процесса представлена на рис. 21, из которого видно, что время установления равновесия значительно больше используемого в эксперименте при определении константы. Поэтому полученное значение С является максимальным и максимальная ошибка, которая допускается при определении Кц, составляет 200—250%.
