Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
К недостаткам метода следует отнести нестабильность конъюгата, обусловленную наличием легко гидролизуемой основной формы акридиновых эфиров. Вследствие этого накладываются ограничения на применение растворов со значением pH, превышающим 6,3.
Схемы ХИА на основе эффекта переноса энергии. Впервые эффект переноса энергии в растворе описал Ферстер (1949), который наблюдал тушение флуоресценции трипофлавина родамином.
к
Позднее им было показано, что этот эффект передачи фотона от донора к акцептору проявляется в тех случаях, когда расстояние между ними не превышает 7 нм. Эффективность процесса переноса энергии определяется диполь-дипольным резонансом /и обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором. /
Важным фактором является расстояние между максимумами спектров хемилюминесцентного излучения донора и флуоресцентной адсорбции акцептора, при этом эффект переноса/ энергии выражается в смещении максимума спектра флуоресцентного излучения акцептора. При увеличении площади перекрывания спектров эффективность процесса переноса энергии возрастает.
Известно, что радиус Стокса молекул IgG с УЦ,= 150 000 составляет около 4 нм, а расстояние до активных центров около 5,5 нм. Таким образом, если на поверхности белковой глобулы расположить 4—12 молекул флуоресцеина, то среди них найдется по крайней мере одна, которая будет акцептором энергии молекулы донора, связанной с активным центром антитела. Для того чтобы эффект переноса энергии между IgG и флуоресцеином наблюдался в растворе, необходимо, чтобы концентрация флуорохро-ма была не ниже, чем 1—10 мМ. Если принять во внимание, что концентрация антител при проведении иммуноанализа составляет 0,01 пмоль, то очевидно, что перенос энергии может наблюдаться только внутри комплекса антиген — антитело и отсутствует между несвязанными молекулами. Этот факт положен в основу гомогенных методов иммуноанализа, базирующихся на эффекте переноса энергии.
• Основные требования к выбору реагентов: 1) хемилюминес-центное соединение, являющееся донором энергии, должно иметь высокий квантовый выход в хемилюминесцентной реакции; 2) флуорохром, используемый в качестве акцептора, должен обладать высоким квантовым выходом флуоресценции; 3) расстояние между максимумами спектров излучения донора и акцептора (стоксовский сдвиг) должно быть достаточно большим.
Сравнительное изучение свойств различных соединений, используемых в качестве маркеров в ХИА и флуорохромов, позволило выбрать для проведения иммуноанализа в качестве хемилюминесцентного маркера антигенов — ABEI и флуорохромной метки антител— флуоресцеина (длина волны возбуждения 495 нм, излучения 525 нм).
При образовании комплекса антиген—антитело наблюдается снижение интенсивности излучения в диапазоне 460—487 нм и увеличение при 525 нм, регистрируемое с помощью двухволнового люминометра.
Гомогенный иммуноанализ на основе переноса энергии описан для определения ряда антигенов с Мг от 312 до 150 000. Отношение интенсивности хемилюминесценции уменьшалось приблизи-
тельно «а 50—70% при связывании меченого антигена с мечеными антителами.
Гомоденный анализ разработан для определения циклического АМР из эритроцитов цыплят и IgG сыворотки крови. Корреляция полученных результатов с данными обычных гетерогенных методов удовлетворительна (для сАМР коэффициент корреляции г=0,91, для IgG — 0,96). Основное преимущество систем с детекцией, основанной на определении отношения интенсивности излучения при двух длинах волн, — это возможность устранения влияния образцам
Подход q использованием систем с переносом энергии только начинает разрабатываться в иммуноанализе и, безусловно, найдет применение как один из вариантов гомогенных методов иммуноанализа. \
• Приведенной обзор данных по применению био- и хемилюминесцентных реакций в иммуноанализе позволяет заключить, что детектирующие системы на их основе обладают большими потенциальными возможностями в плане повышения точности и чувствительности методов иммуноанализа, разработки новых вариантов экспресс-определения, создания систем автоматического определения.
iii
il антител
Получение антисывороток и поликлональш
Процесс введения животному антигена по разработанной схеме называется иммунизацией, а сыворотка крови иммунизированных животных — антисывороткой. В литературе описано большое разнообразие способов иммунизации, зависящих от структуры антигена, его доступных количеств, вида животного и т. д. По этим причинам условия получения йммунных сывороток подбираются эмпирически. Тем не менее имеются общие закономерности,, которые позволяют выбрать условия получения высокоактивных антисывороток.
§ 1. Иммуногенность антигенов
Иммуногенность антигена—это способность ¦ ь з орагнизме иммунизированного животного образование антител. Иммуногенность как биологическое свойство антигена является более сложным, чем антиген-ность. Антигенности того или иного вещества недостаточно, чтобы вызвать образование антител. В качестве примера можно привести гаптены, которые приобретают иммуногенность только после конъюгирова-ния с соответствующим носителем.
