Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
При разработке методов ИФА обычно пользуются значением титра антисыворотки, определенным в непрямом методе, в котором на стенках лунок микроллаты первоначально сорбируют ан-
тиген и затем изучают связывание с ним иммунной сыворотки в последовательных разведениях. Связывание исследуемых антител с иммобилизованным антигеном регистрируют с помощью антиви-дового конъюгата к иммуноглобулиновой фракции сыворотки животного, используемого для иммунизации.
Результаты в этом случае обычно оценивают с помощью понятия «50%-ный титр». На рис. 18 приведены кривые титрования антисывороток к инсулину, полученных иммунизацией морских свинок. Максимальный сигнал, регистрируемый по оптической плотности А продукта реакции окисления перекисью водорода 5-аминосалициловой кислоты, составляет ~1,4 оптических единиц. За титр сыворотки принимается ' такое разведение, при котором оптическая плотность, регистрируемая в ИФА, имеет значение, близкое к 0,7.
Обычно такой подход используется в качестве
1-го этапа оценки качества полученных иммунных сывороток и позволяет отобрать высокоактивные иммунные сыворотки. Однако для более глубокой оценки полученных антител проводят определение их аффинности. При разработке методов ИФА ряда антигенов, присутствующих в биологических жидкостях в низких концентрациях порядка 10~10—10ПМ (например, инсулин и другие полипептидные гормоны), должны быть использованы антисыворотки, имеющие не только высокий титр, но и достаточное содержание антител, обладающих высокой константой связывания (высокоаффинных антител).
Аффинность антител. Традиционные методы определения аффинности антител, позволяющие вычислять константу равновесия, основанные на изучении связывания меченого антигена с антителами, были изложены в гл. 2, § 3. В основном в таких экспериментах применяются иммобилизованные антитела и антигены, ме-
tog2 п
Рис. 18. Титрование антисывороток (/ — 4) к инсулину методом непрямого твердофазного ИФА:
по оси абсцисс — разведение разбавленной в 100 раз сыворотки (п), по оси ординат — оптическая плотность при 430 им продукта пероксидазиого окисления 5-амииосалициловой кислоты перекисью водорода. В качестве контроля (jV) использована сыворотка крови ие-иммуиизироваииого животного
ченные радиоактивной меткой (не вносящей существенных изме- ' нений в структуру антигена).
При использовании ферментных меток химическая структура меченого антигена может существенно отличаться от немеченого (так, например, могут быть получены конъюгаты с различным мольным соотношением антиген/фермент). В этих случаях полученные значения констант связывания характеризуют, как правило, взаимодействие в данг ной конкретной системе, вследствие” чего иммунная сыворотка, обладающая высокой аффинностью в реакции с конъюгатом одной структуры, может иметь значительно более низкие значения константы связывания с конъюгатом, полученным другим способом.
Если исследователь имеет
1,0 2,0 3,0 дело с разработкой конкурент-
lg [И'нс -ПК], [нг/мл] НЫх методов ИФА, т. е. распо-
лагает набором иммунных сы- .
пГ Инсу‘ вороток и конъюгатом анти-
лин — пероксндаза (Инс — 11л) с ад- . .
сорбированными на полистирольном- ген фермент, то важным эта-планшете антителами против инсулина, ПОМ создания тест-системы ЯВ-выделенными из разных сывороток: ляется выбор пары антитело—
4М°НМ продукта"”перокснм^но^р^акСцнн^ою)с- конъюгат, характеризующейся
лення о-феннленднамнна перекисью водорода. Необходимой КОНСТЭНТОЙ ВЗЗИ' Константы связывания антител нз сывороток . «» г-»
1 и 2 (в М—*) равны 1010 н 109 соответствен- МОД6ИСТВИЯ. «ДЛЯ ПрОВСДСНИЯ
но; N — контрольная нормальная сыворотка СКрИНИНГЭ у-ТЛОбуЛИИОВуЮ
фракцию каждой антисыворот-ки иммобилизуют на поверхности микропланшета и изучают ее связывание с имеющимся набором конъюгатов. Эффективное значение /Ссвяз является величиной, обратной значению концентрации конъюгата, при которой связывается 50% активных центров на носителе.
На рис. 19 приведены кривые связывания иммобилизованных на полистироле антител к инсулину с конъюгатом инсулин — пе-роксидаза. Исследуемые сыворотки различаются по значениям эффективных констант равновесия. Для количественного определения инсулина могут быть использованы антисыворотка и конъюгат, эффективная константа связывания которых ~109 Мг1. Для других тест-систем допустимое значение Кэф будет определяться требованиями, предъявляемыми к чувствительности и точности разрабатываемого метода.
Описанная процедура скрининга иммунных сывороток, как отмечалось выше, применима при наличии конъюгата антиген — фер-
мент. Получение такого конъюгата для широкого круга антигенов представляется непростой задачей. Более универсальным реагентом (коммерческим) являются антитела, меченные ферментом, поэтому остановимся на более общем подходе к определению аффинности антител в сыворотке или асците, основанном на твердофазном ИФА. Этот метод, предложенный Б. Фриге, позволяет определять константу связывания антител с антигеном (немечен-ным) при их взаимодействии в растворе.
