Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
В результате ферментативного гидролиза получают (Fab') 2-фрагменты антител против определяемого антигена и используемого фермента. Смешивают продукты гидролиза и подвергают их воздействию восстанавливающего агента (например, меркапто-этанола), вследствие чего (Fab')2-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента происходит рекомбинация Fab-фрагментов, в результате чего наряду с исходными образуются гибридные (Fab7)2-фрагменты, один активный центр которых специфичен к детерминантам антигена, а второй — фермента.
При добавлении фермента образуется комплекс (Fab') 2-фермент, который может применяться для определения антигена в рассмотренных выше методах ИФА с использованием меченых специфических антител (например, в «сэндвич»-методе). При необходимости ферментная метка может вводиться после взаимодействия гибридного антитела с определяемым антигеном. Хотя этот подход был предложен около 20 лет назад и привлекает своей «элегантностью», он не нашел практического применения из-за трудоемкости получения реагентов.
Следующий метод нековалентного введения ферментной метки в гетерогенном ИФА антигенов и антигел основан на использовании авидина (основной гликопротеид, Л4Г = 66000, компонент яичного белка) и биотина (витамин, Мг=228), образующих между собой комплекс, характеризующийся константой связывания 1015 М-1, что в десятки тысяч раз превышает характеристики связи антиген — антитело. Один из вариантов ИФА антител с использованием этой техники может быть проведен по схеме (см. с. 106).
Иммобилизованный антиген инкубируют с пробой, содержащей антитела, отмывают и добавляют антивидовые антитела, ковалентно связанные с биотином. Затем вносят авидин, образующий прочный комплекс с биотином, отмывают избыток белка и добавляют фермент с ковалентно пришитым биотином, который взаимодействует с другим центром связывания авидина. (Другим путем является использование антивидовых антител, ковалентно связанных с авилином, что упрощает анализ и сокращает его длительность.
• Достоинствами данного подхода являются универсальность конъюгата, используемого для анализа различных антигенов, и повышение чувствительности регистрации образуемого иммунохимиче-ского комплекса. Последнее обстоятельство обусловлено тем, что при синтезе конъюгата антитело—биотин с одной молекулой антитела может быть ковалентно связано до 90 молекул биотина. Молекула авидина имеет четыре центра связывания биотина, поэтому каждый специфический иммунохимический комплекс с участием определяемых антител на конечной стадии анализа будет содержать не одну молекулу фермента, а несколько десятков, что приводит к существенному выигрышу в чувствительности определения метки, а следовательно, и всего анализа.
У—
У—
-°>“
|-о + >— !-о>-
31 ?"ч Ч *) ин*Убация I ..
| + /“ "t ¦¦» Я__Ч 2) отмывка
ю>- >*
^ ^ 3) инкубация^ р
|-о>—
4) отмывка Я
I-о д^+х
6) отмывка
<ь© <нэ
1-0 + <нэ <нэ
дгх
7) инкубация ^
Н||НЭ
1-о>^?
+<ь®
ю - 2 —
Н§НЕ)
<нэ <ь®
8) отмывка
Недостатками метода являются многостадийность, необходимость предварительной модификации как антител, так и фермента и наличие достаточно высокого уровня неспецифического связывания у молекулы авидина, так как, являясь по своей природе гликопротеидом, этот белок имеет высокую изоэлектрическую точку и способен к комплексообразованию с другими белками. Последний из недостатков может быть устранен использованием в качестве специфического к биотину белка не авидина, а стрептавидина. Молекула стрептавидина обладает также четырьмя высокоаффинными центрами связывания биотина, но имеет изоэлектрическую точку, близкую к нейтральной, и в меньшей степени склонна к неспецифическому связыванию с антителами.
9 Еще один метод нековалентного введения ферментной метки основан на применении конъюгатов антител с лектинами — растительными белками, способными специфически связываться с углеводными остатками, входящими в состав биомолекул. В связи с этим лектины применяются для очистки и выделения гликопротеидов.
Одним из широко используемых для этой цели лектином является конканавалин А из бобов конавалии (Afr = 96 000). Ковалентный конъюгат антител с лектином получают с помощью глутарового альдегида. Выделенные конъюгаты могут использоваться для определения антигенов и антител. Одна из возможных схем проведения ИФА антител на основе конъюгата фермента с лектином имеет вид
2) отмывка
\-osA
3) инкубация
4) отмывка
5) инкубация ^
ff-O + ^
6) отмывка
где —^ — лектин, S) - фермент, содержащий углеводный компонент
Исследуемые антитела взаимодействуют с иммобилизованным антигеном. После промывки добавляют конъюгат антивидовых антител с лектином в присутствий избытка специфического для лекти-на углевода (например, метил-р-?>-маннозида в случае конканава-лина А) для предотвращения связывания лектина с углеводным компонентом антител и иммобилизованного антигену.
