Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Активность многих ферментов (пероксидаза, каталаза, глюко-зооксидаза) может быть измерена электрохимическим путем. В связи с этим значительный интерес представляют иммунофер-
ментные электроды, которые являются еще одним аппаратурным решением для твердофазного ИФА в кинетическом режиме.
Принцип работы одного из типов анализатора заключается в следующем. Определяемые и меченные ферментом (каталазой или глюкозооксидазой) антигены конкурируют за центры связывания антител, иммобилизованных на мембране, окружающей кислородный электрод Кларка. После проведения иммунохимической реакции отмывают несвязавшиеся на мембране компоненты исследуемой смеси и вводят растворы субстратов фермента. Измеряемый ток на электроде пропорционален концентрации кислорода, поглощаемого (или выделяемого) в ферментативной реакции, осуществляемой связанным с антителами ферментным конъюгатом. Процедура регистрации иммобилизованных антител Позволяет использовать устройство многократно. Время анализа белковых антигенов (альбумин, инсулин) составляет 15 мин при чувствительности 5—
10 мкг/мл. Возможно в качестве меток применять другие ферменты (щелочная фосфатаза, дегидрогеназа и др.), которые образуют электрохимически активные продукты реакции, определяемые в проточных системах.
• Иммуноферментные электроды просты и удобны в работе. Их применение целесообразно для быстрого анализа соединений, не требующего высокой чувствительности.
§ 6. Новые подходы . в гетерогенном ИФА
Применение в ИФА антигенов и антител, иммобилизованных на нерастворимых носителях, дает возможность эффективно разделять компоненты аналитической системы перед стадией определения концентрации ферментной метки. Такой подход универсален и может применяться для широкого круга соединений — от гаптенов до микробных клеток. Однако нерастворимые иммуносорбенты имеют и некоторые отрицательные стороны, а именно: 1) возможность неспецифического связывания компонентов с носителем; 2) значительное время анализа (до нескольких часов) из-за длительности реакции антиген — антитело, определяемое низкой концентрацией иммобилизованного агента- (например, при использовании непористых сорбентов — полнстирольных плат или пробирок) или диффузионными затруднениями при использовании пористых сорбентов (сефароза, пористое стекло, силохром и т. д.); 3) методические сложности, связанные с трудностями точного дозирования и промывок иммуносорбентов на основе пористых носителей; 4) существенное влияние неоднородности сорбциоииых свойств полимерных носителей (микроплаты и пробирки из полистирола, поливинилхлорида, полиметилметакрилата и т. д.) на точность и воспроизводимость результатов анализа.
Большинство этих недостатков устраняется при переходе к гомогенным видам анализа, основанным на эффекте модуляции активности фермента при образовании комплекса антиген — антитело. Однако на сегодняшний день эти методы в совершенстве разработаны в основном для анализа низкомолекулярных антигенов. В связи с этим представляют интерес методы ИФА, позволяющие анализировать различные по молекулярной массе соединения без применения твердых носителей.
Одним из подходов является проведение стадии «узнавания» определяемого соединения специфическими антителами в растворе и дальнейшее разделение компонентов путем перевода образовавшегося специфического комплекса в нерастворимое состояние. По приведенной выше классификации такие методы относятся к гомогенно-гетерогенным. 'Разделение компонентов чаще всего достигается с помощью образующих преципитат антивидовых антител. Возможно использование в качестве осадителя полиэтиленгликоля и других соединений. Недостатком метода является длительность процесса разделения, в ряде случаев лимитирующего время всего анализа, и необходимость тщательного подбора условий осаждения.
Перспективный метод ИФА основан на применении антител, иммобилизованных на водорастворимом полимере. Принцип анализа состоит в следующем. К раствору иммобилизованных на полианионе антител добавляют определяемый и меченный ферментом антиген и проводят реакцию конкурентного связывания. Для разделения свободного и связавшегося в комплексе конъюгата вносят поликатион, который быстро и количественно образует с полианионом нерастворимый поликомплекс. После разделения жидкой и твердой фаз регистрируемая в надосадочном растворе или осадке ферментативная активность дает информацию о начальной концентрации исследуемого антигена. Для удобства измерения активности полученный осадок может быть вновь легко растворен при увеличении ионной силы.
• Достоинствами данной модификации ИФА являются: 1) отсутствие твердой фазы; 2) быстрота разделения компонентов реакционной системы (I тип); 3) экспрессность при сохранении высокой чувствительности (время определения IgG человека в концентрации 1(Н0 М не превышает 10 мин); 4) возможность быстрого анализа антигенов с различной молекулярной массой. К основным недостаткам, снижающим универсальность метода, относятся возможность неспецифической сорбции соединений на полианионе или поликатионе и необходимость стадии промывки нерастворимого поликомплекса при определении ферментативной активности в осадке.
