Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
• Так как перед стадией регистрации ферментативной активности проводят отмывку носителя от компонентов исследуемых жидкостей, то метод исключает влияние на ферментативную активность и, следовательно, на результаты анализа присутствующих в анализируемой пробе эффекторов.
«Сэндвич»-метод методически упрощается, если анализируемый антиген и меченые антитела добавлять к иммуносорбенту одновременно. Схема метода:
Иногда в литературе эта схема Называется одностадийным «сэндвич»-анализом. Как и в предыдущем случае, на носителе образуется тройной комплекс с участием меченых антител, концентрация которого пропорциональна начальной концентрации определяемого антигена.
Однако чувствительность одностадийной схемы ниже, чем двухстадийной, а контакт фермента с анализируемой средой может неблагоприятно отражаться на результатах анализа. Данная схема налагает также дополнительные требования на соотношение концентраций меченых и иммобилизованных антител с целью исключения их конкуренции за связывание с ограниченным числом антигенных детерминант на молекуле антигена. В этой связи целесообразным является использование В'анализе моноклональных антител, специфичных к различным антигенным детерминантам на м<злекуле антигена. Следует подчеркнуть, что данный метод анализа не может быть отнесен к конкурентному типу, так как формирование комплекса антигена с мечеными иди иммобилизованными антителами не
2) отмывка
3) определение ферментативной активности
исключает возможности образования тройного «сэндвича-комплекса.
б. Метод с использованием меченых антивидовых антител и иммобилизованных специфических антител. Схема метода:
Метод является усложненным вариантом обычного двухцентро-вого или «сэндвич»-анализа, в котором образование комплекса детектируется не непосредственно введением в него меченного ферментом антитела, а с помощью содержащих ферментативную метку антивидовых антител. В качестве антивидовых (или вторичных) используют антитела, специфичные к глобулинам тех видов животных или птиц, которых иммунизировали антигеном для получения антисыворотки. Примером наиболее распространенных «антивидовых» конъюгатов являются меченные ферментом антитела кролика против иммуноглобулинов человека, меченые антитела козы (осла, барана и т. д.) против иммуноглобулинов кролика и т. д.
2) отмывка
6) отмывка
7) определение ферментативной активности
• Для того чтобы меченые антивидовые антитела не связывались с иммобилизованными на поверхности, необходимо использовать при образовании «сэндвич»-комплекса антитела, полученные от разных видов животных (на схеме такие антитела обозначены как
и )— • Несмотря на многостадийность и длительность прове-
конъюгата, который может быть применен для анализа различных j антигенов. ' 1
Описанными методами ограничивается число возможных ана- j лизов антигенов по типу I. В табл. 4.1 для наглядности оставле- j ны пустые графы, соответствующие конкурентным твердофазным | методам, а также схемам с мечеными антигенами. |
Гетерогенные методы ИФА антител, основанные на определении j специфических иммунных комплексов (тип I). Так же, как в случае | анализа антигенов, все методы определения антител, относящихся ! к данному разделу, являются неконкурентными (табл. 4.2). !
Метод с использованием меченых вторичных антител и иммоби- i лизованных антигенов. Схема метода: j
К иммобилизованному антигену добавляют исследуемую сыворотку и после инкубации и удаления несвязавшихся компонентов
дения, достоинством метода является универсальность антивидового j
выявление специфических иммунокомплексов проводят с помощью меченных ферментом антивидовых антител. Измеряемое на носителе содержание ферментной метки пропорционально концентрации специфических антител в сыворотке.
Данная схема является одной из наиболее распространенных-в ИФА антител, так как обладает всеми достоинствами «сэндвич»-метода, но отличается универсальностью меченого реагента, что дает возможность выявлять антитела к разным антигенам. Данный подход позволяет решать проблемы серодиагностики заболеваний человека и сельскохозяйственных животных, используя ограниченный набор антивидовых иммуноферментных конъюгатов, что значительно облегчает задачу производства реагентов для ИФА.
Метод с использованием меченого антигена и иммобилизованного антигена. Схема метода":
4) отмывк» 2
1,-0
5) определение ферментативной активности
Исследуемую пробу инкубируют с иммобилизованным антигеном, после отмывки несвязавшихся компонентов для выявления образовавшегося специфического комплекса проводят инкубацию с меченным ферментом антигеном. Выявление образовавшихся на первой стадик имМунохимических комплексов происходит за счет взаимодействия свободных центров связывания с добавляемым в избытке меченным ферментом антигеном.
