Теория и практика иммуноферментного анализа - Егоров А.М.
ISBN 5-06-000644-1
Скачать (прямая ссылка):
Схема 4.4
Введение метки в молекулу антигена является одним из наиболее распространенных подходов в гомогенных методах ИФА. Эти методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохимического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда.
Необходимым условием гомогенного ИФА является изменение наблюдаемой ферментативной активности при взаимодействии меченого антигена с антителами. Механизмы модуляции актйвности могут быть различными. К основный из них относятся следующие:
1) исключение субстрата из ферментативной реакции вследствие стерйческого затруднения взаимодействия субстрата с ферментом, возникающего при образовании иммунохимического комплекса меченого антигена с антителами;
2) индуцируемое антителами конформационное изменение структуры молекулы фермента-метки, приводящее к изменению ферментативной активности;
3) модуляция антителами способности кофакторов, субстратов, ингибиторов и других соединений участвовать в ферментативной реакции.
Методы анализа антигенов, основанные на использовании меченных ферментом антигенов. Стерическое исключение субстрата. На этом принципе был основан первый гомогенный метод ИФА, разработанный в 1972 г. н вошедший в литературу под названием
«EMIT» (англ. enzyme multiplied immunoassay technique). Суть его состоит в следующем. Низкомолекулярный антиген ковалентно связывают с ферментом лизоцимом вблизи активного центра. В комплексе с антителами активный центр фермента становится стерически недоступен макромолекулярному субстрату, которым являются стенки бактериальных клеток. Схема метода может быть представлена следующим образом:
При увеличении концентрации определяемого антигена концентрация неактивного комплекса конъюгата с антителами снижается, а следовательно, возрастает регистрируемый параметр ферментативной. реакции. На основе данного подхода были разработаны наборы для определения широкого круга наркотических и лекарственных средств.
• Существенным достоинством EMIT-анализа является экспресс-ность определения, которая составляет 2—5 мин. К недостаткам метода следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл), и возможность определения только низкомолекулярных антигенов.
Принцип стерического исключения субстрата был иснользован также для разработки метода определения макромолекулярных антигенов, таких, как альбумин, иммуноглобулины G и М. В анализе используют конъюгат антигена с р-?>-галактозидазой Е. coli. После образования комплекса с антителами активный центр фермента становится недоступным для взаимодействия с искусственно синтезированным макромолекулярным субстратом о-нитрофенил-р-?>-гатактозидом, ковалентно связанным с водорастворимым полимерным декстраном. В присутствии антигена «степень ингибирования» фермента уменьшается пропорционально концентрации исследуемого соединения. Метод позволяет измерять IgG в микро-граммовыхколичествах в течение нескольких минут.
Индуцируемое антителами изменение активной конформации фермента. Известно, что в результате комплексообразования антител с антигенами в молекулах реагирующих соединений могут про-
исходить конформационные изменения. Такие же структурные из-' менения в молекулах ферментов могут наблюдаться при связывании антител с конъюгатами антиген — фермент. Если в результате такого взаимодействия фермент переходит в другую конформацию, при которой его каталитическая’активность сильно меняется, то это явление может быть положено в основу методов гомогенного ИФА.
На практике данный подход был реализован на примере многих низкомолекулярных антигенов и других ферментов—малатдегид-рогеназы печени свиньи и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, и также известен под названием «ЕМ1Т». Используют конъюгаты ферментов с гаптенами, которые незначительно отличаются по активности от нативного фермента. При взаимодействии с антителами против гаптена в молекуле фермента происходят конформационные изменения, затрагивающие структуру активного центра, в результате чего ферментативная активность сильно ладает. Введение в реакционную систему свободного антигена приводит к уменьшению концентрации комплексов конъюгат—антитело, а следовательно, измеряемая активность при увеличении концентрации анализируемого соединения также возрастает.
Схема метода аналогична случаю с исключением субстрата, только механизм изменения каталитической активности в иммуно-химическом комплексе с конъюгатом имеет другую природу.
• Для некоторых гаптенов (тироксин и трийодтиронин) оказалось, что их ковалентное связывание с ферментом приводит к полному падению его каталитической активности, обусловленному относительной подвижностью находящегося в непосредственной близости от активного центра фермента гаптена и возможным ингибирующим его действием на связывание субстрата. В свободном состоянии конъюгат неактивен, но его связывание с антителами приводит к реактивации фермента и степень реактивации однозначно связана с концентрацией определяемого гаптена в растворе.
