Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
экстракцию следует проводить в пробирках из полиалломера, полипропилена
либо пирекса. Настоятельно не рекомендуется использовать пробирки из
поликарбоната и полиэтилена. Кроме того, у хлороформа невысокая точка
кипения. Следовательно, перед добавлением хлороформа экстракты необходимо
охладить до комнатной температуры, а после их встряхивания следует
осторожно выпустить пар, скопившийся в пробирках. Два последних условия
особенно важны при выделении больших количеств ДНК. Поскольку пары как
хлороформа, так и октанола оказывают раздражающее воздействие, выделение
ДНК. как правило, проводят под тягой. Эти две жидкости, а также растворы
этанола обычно растворяют чернила фломастера, следовательно, необходимо
следить за тем, чтобы надписи не смывались.
"*) Готовые силиконирующие растворы, такие, как "Сигмакот" (Sigma), можно
использовать для предотвращения адсорбции и, следовательно, возможных
потерь ДНК, а также предотвращения прилипания осадка к стенкам пробирки и
облегчения сбора небольших объемов водных растворов в больших
центрифужных пробирках. Завинчивающиеся крышки с тефлоновыми прокладками
тоже предотвращают потери нуклеиновых кислот, которые могут произойти при
перемешивании.
•*> После добавления СТАВ-буфера для осаждения нуклеиновые кислоты можно
оставить для формирования осадка на более длительное время, даже на ночь,
если поддерживается температура выше 20°С. Необходимо убедиться, что
СТАВ-буфер для осаждения хорошо перемешан. В связи с тем что в нем не
содержится соли, этот буфер оказывается легче гораздо более плотного
СТАВ-буфера для экстракции. При добавлении буфера для осаждения иногда
образуются осадки комплексов нуклеиновая кислота/СТАВ не совсем белого
цвета. В некоторых случаях они волокнистые либо может постепенно
образовываться мелкодисперсный осадок. Следует обратить внимание, какой
осадок образуется при осаждении нуклеиновых кислот из каждого образца, и
определить, обусловлен ли данный тип осадка низким выходом либо
чрезмерным загрязнением. Если осадок не образуется, возможно, что клетки
содержат значительные количества солей, и для снижения их концентрации
можно дополнительно добавить СТАВ-буфер для осаждения. Если нуклеиновые
кислоты по-
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
245
прежнему не выпадают, можно попытаться осадить их добавлением
2,5 объемов холодного (-70 °С) этанола. Однако при этом могут выпасть
в осадок и загрязняющие препараты полисахариды.
Весьма важно избегать осаждения нуклеиновых кислот СТАВ-буфером при
слишком большом ускорении, поскольку очень плотные осадки могут плохо
растворяться. Во избежание этого следует использовать настольную
низкоскоростную центрифугу с бакет-ротором. При работе с небольшим
количеством материала, как правило, нуклеиновые кислоты вполне успешно
осаждаются в мини-центрифуге и впоследствии ресуспендируют-ся, если
работать осторожно. Осадок СТАВ/нуклеиновая кислота весьма стабнлен, и
стадию осаждения целесообразно проводить в течение ночи.
*> После осаждения осадок должен быть чисто белого цвета, коричневые
полифенолы и большая часть полисахаридов остаются в растворе. Если этого
не происходит, то после растворения осадка препарат нуклеиновых кислот
следует обработать фенолом для удаления примесей (разд. 5.2, примечание
б).
к> Если необходим чистый препарат, особенно при выделении ДНК с помощью
СТАВ-буфера в большом масштабе (приложение 4 [I]), то на этой стадии ДНК
может быть очищена в градиенте CsCl/БЭ, как описано в приложении 4 [II].
Перед осаждением этанолом необходимо убедиться в полном растворении
осадка. СТАВ обычно растворяется весьма быстро, однако прозрачный осадок
нуклеиновых кислот может не раствориться и всплыть со дна пробирки.
"> Этанол осаждает нуклеиновые кислоты, а промывание растворами этанола
способствует удалению остатков СТАВ из препаратов нуклеиновых кислот, что
необходимо для обработки рестриктазами.
Требуется лишь непродолжительная сушка в эксикаторе. Некоторые
препараты ДНК могут растворяться в течение 1-2 ч, и поэтому следует
убедиться, что осадок полностью растворился, прежде чем определять
концентрацию ДНК или проводить любой другой анализ. Необходимо отметить,
что раствор содержит РНК, главным образом рРНК¦ Если раствор слишком
вязок, возможно вследствие большого количества рРНК1 или полисахаридов,
его можно дополнительно разбавить. РНК, содержащаяся в образце, обычно не
влияет на обработку рестриктазами и часто выходит из геля при
электрофорезе. Если необходимо, РНК можио удалить РНКазой А (разд.
4.2.3.2, стадии 10-13).
Данный метод в зависимости от типа ткани дает выход от 50 до 200 мкг
ДНК на ОД г лиофнлизированного материала.
4.2.3. Выделение ДНК с помощью протеиназы
4.2.3.1. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Пестики и ступки (12-15 см в диаметре).
- Окись алюминия (Sigma, тип 305).
- Одноразовый респиратор.
- Центрифуга Sorval RC-5B (либо аналогичная) с ротором 8X50 мл.
