Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
2,0 М трис-НС1, pH 7,2 0,5 мл
MgCl2-6H20 0,1 г
Автоклавируют и добавляют 14 мкл 2-МЭ непосредственно-перед
использованием.
- Буфер для промывания ядер идентичен буферу для выделе--ния, но
дополнительно содержит 0,5% Т-ритон Х-100.
- 2,0 MHEPES (разд. 5.6.2).
- 1,0 М дитиотриэтол (ДТТ). Растворяют 3,09 г ДТТ в 20,0 мл?
дистиллированной Н20. Стерилизуют фильтрованием. Ни в коем случае не
автоклавируют ни ДТТ, ни содержащие его растворы.
- Буфер для хранения ядер (250 мМ сахароза; 20 мМ HEPES,. •pH 7,8; 5 мМ
MgCl2, 1 мМ ДТТ, 50%-ный глицерин),~ На 100 мл:
Сахароза 8,55 г
256
Глава 4
2.0 М HEPES, pH 7,8 1,0 мл
MgCl2-6H20 ОД г
1.0 М ДТТ 0,1 мл
Глицерин 50,0 мл
- Буфер для лизиса (10 мМ трис-НС1, pH 7,2; 10 мМ ЭДТА;
0,5%-ный Тритон Х-100). На 100 мл:
2.0 М трис-НС1, pH 7,2 0,5 мл
0,5 М ЭДТА 2,0 мл
Тритон Х-100 0,5 мл
- Двукратный СТАВ-буфер для экстракции [100 мМ трис-НС1, pH 8,0; 0,7 М
NaCl, 20 мМ ЭДТА; 2%-ный (вес на объем) СТАВ]. См. состав СТАВ-буферов в
разд. 4.2.2.1.
- 80- и 30%-ный растворы пер кола (Pharmacia) в буфере для выделения
ядер. •
- 2-МЭ (Sigma).
- Диэтиловый эфир (BDH Analar).
4.4.1.3. Методика
1. Взвешивают 200 га> молодых листьев и помещают их в стаканы из пирекса
объемом 1 л. Работая под тягой, заливают листья холодным (2°С) диэтиловым
эфиром6* и перемешивают в течение 1-2 мин. Сливают эфир и промывают
листья холодной (2°С) дистиллированной НгО. Последующие стадии •проводят
на льду, желательно в холодной комнате.
2. Удаляют средние жилки (при использовании листьев) и нарезают ткань
бритвой на маленькие кусочки. Это удобно делать в чашке Петри диаметром
14 см.' В случае каллуса целесообразно использовать 100-150 г тканив>.
3. Гомогенизируют растительный материал в 400 мл буфера для выделения
ядерг>, используя гомогенизатор "Политрон" на средней скорости (3) в
течение 1-2 мин. Если среда начнет пениться, -необходимо приостановить
гомогенизацию. Ткань можно гомогенизировать и в предварительно
охлажденном
. смесителе Уоринга при средней скорости 2X5 с.
4. Фильтруют гомогенат через четыре слоя стерильной бязи и один слой
Miracloth (либо капрона) в стерильный стакан объемом 1 л.
5. Переносят гомогенат в стерильные центрифужные стаканы большого объема
и собирают неочищенный осадок ядер центрифугированием при 500 g (10 мин,
4°С).
8. Ресуспендируют осадки в 25 мл буфера для промывания ядер, используя
гомогенизатор Поттера, и осаждают ядра в сили-конированных стерильных
пробирках из корекса в бакет-ро-торе при 500 g (10 мин, 4°С). Продолжают
промывание (3-
4 раза) до тех пор, пока ядра не освободятся от -клеточного
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
257
дебриса. Если требуются сверхчистые препараты, ядра можно наслоить на
ступенчатый градиент плотности перкола [ 16]г)' д).
7. Ресуспендируют ядра на ледяной бане в 5 мл буфера для лизиса и
разрушают их в течение 5 мин, встряхивая 10 раз по 5 с. Перед каждым
встряхиванием гомогенат следует охлаждать на льдуе).
8. Добавляют 0,1 мл 2-МЭ и 5 мл двукратного СТАВ-буфера для экстракции,
предварительно прогретого до 95°С, и быстро перемешивают пластмассовой
палочкой. Далее следуют приложению 4 [I] (выделение больших количеств
ДНК, стадия 4 и далее).
Примечания
*> Методика может быть модифицирована в зависимости от количества
имеющегося в распоряжении растительного материала. Изложенная выше
методика рассчитана на стандартный ротор объемом 4X250 мл.
Диэтиловый эфир способствует растворению восковидной кутикулы и
разрушению клеток. Для более эффективного разрушения клеток можно
обрабатывать каллус или клеточную суспензию растворами целлюлазы.
*> Можно использовать и другой буфер для выделения ядер на основе гек-
силенгликоля (разд. 4.4.2.2).
г> Ресуспендируют ядра в 7 мл буфера для выделения и наслаивают на
ступенчатый градиент плотности перкола, приготовленный из 7 мл 35%-
иого перкола и 7 мл 80%-ного перкола, растворенного в буфере А для
выделения ядер в стерильных силиконированных пробирках из корекса.
Центрифугируют в бакет-роторе при 8000 g в течение 30 мин при 4 °С. Между
двумя слоями будут располагаться ядра, свободные от клеточного дебриса,
что контролируют с помощью окрашивания акридиновым оранжевым (приложение
2 [VII], В). Эту зону отбирают и разводят 25 мл буфера для выделения
ядер. Ядра осаждают и еще раз промывают тем же буфером (1000 g, бакет-
ротор).
Очищенные ядра можно суспендировать в буфере для хранения и хранить
при -70 °С.
В некоторых случаях выделению ДНК способствует процедура оттаивания-
замораживания ядерного осадка, а также обработка лизированных ядер
протеиназой в течение 30 мин при 37 °С в 5 мл буфера для лизиса.
Последний содержит 500 мкг/мл предварительно проинкубированной про-назы
