Генная инженерия растений. Лабораторное руководство - Дрейпер Дж.
ISBN 5-03-001854-9
Скачать (прямая ссылка):
4.3.4.2. Методика
1. Собирают свежую ткань, разрезают или размалывают наг
мелкие кусочки и замораживают в жидком азоте.
2. Растирают по 0,75 г каждого замороженного в жидком азоте образца в
маленькой ступке с пестиком. Переносят замороженный порошок в другую
ступку с пестиком, добавляют 750 мкл буфера для экстракции и тщательно
перемешивают.
3. Переносят гомогенат в пробирку Эппендорф на 1,75 мл и инкубируют при
37 °С в течение 90 мин.
4. Добавляют 750 мкл смеси фенол/хлороформ и эмульгируют
перемешиванием.
5. Разделяют фазы центрифугированием в течение 10 мин &. мини-
центрифуге. Переносят верхнюю водную фазу в новую" пробирку Эппендорф.
6. Добавляют 450 мкл изопропанола, перемешивают, переворачивая
пробирку, и центрифугируют в течение 30 с.
7. Промывают осадок в 70%-ном этаноле и растворяют в. 150 мкл ТЭ-буфер
а.
8. При необходимости удаляют избыток углеводов, осаждая их.
метоксиэтанолома).
9. Добавляют 1 мкл предварительно прогретого исходного раствора РНКазы
и затем инкубируют 1 ч при 37 °С.
10. Повторяют экстракцию, добавляя 200 мкл смеси фенол/хлороформ.
11. Экстрагируют водную фазу, добавляя 200 мкл хлороформа.
12. Смешивают с водной фазой 30 мкл 3 М ацетата натрия. Добавляют 1 мл
этанола, предварительно охлажденного до" -20°С, и осторожно перемешивают
раствор, переворачивая, пробирку, чтобы осадить ДНК.
13. Осаждают ДНК центрифугированием .в течение 2 мин, промывают осадок
70%-ны:м этанолом, высушивают в эксикаторе и растворяют в 50 мкл
дистиллированной Н20.
254
Глава 4
14. Определяют концентрацию ДНК в реакции с дифениламином (разд. 1.6).
Примечание
Углеводы можно удалить с помощью метоксиэтанола следующим образом:
1) Добавляют 150 мкл 2,5 М К2НРО4 (pH 8,0) и перемешивают. Добавляют
150 мкл 2-метоксиэтанола, тщательно перемешивают и центрифугируют при 12
000 об/мин в течение 10 мин.
2) Переносят верхнюю водную фазу в новую пробирку и добавляют
2,5 объема этанола, охлажденного до -20 °С.
3) Центрифугируют при 12 000 об/мин в течение 10 мии.
4) Оттесняют осадок ДНК на одну сторону пробирки и удаляют со диа
весь избыток влаги.
5) Промывают ДНК 70%-ным этанолом, высушивают в эксикаторе н
растворяют в 150 мкл ТЭ-буфера.
*4.4. Выделение ядерной ДНК
Разработаны методы выделения ядерной ДНК из каллуса, листьев,
протопластов и отдельных клеток. В каждой лаборатории используют
определенные варианты методик, которые обычно -подразумевают разрушение
свежего растительного материала, удаление неразрушенной ткани
фильтрованием, фракционирование клеточных компонентов дифференциальным
центрифугированием, обработку ядер ДНКазой, лизис, депротеинизацию и
последующую очистку нуклеиновых кислот в градиенте плотности CsCl/БЭ [6,
16]. В данном разделе изложены методики, которые можно взять за основу
при разработке способов выделения ядерной ДНК из различного растительного
материала. Кроме того, ядра, выделенные, как указано ниже, могут
использоваться в экспериментах по транскрипции in vitro для
количественной оценки экспрессии определенных генов [7, 15] или с другими
целями.
4.4.1. Выделение ядерной ДНК из свежих каллусов или листьев
4.4.1.1. Общие положения
В приведенной ниже методике для стабилизации ядер и предотвращения
их разрыва используют сахарозу. Однако во многих лабораториях в качестве
альтернативной среды для экстракции применяют гексиленгликоль L16J.
Соответствующая методика представлена в разд. 4.4.2. Предлагаемый метод
разработан для свежих листьев Nicotiana tabacum. При работе с
определенным растительным материалом иногда необходимо подобрать
соответствующую интенсивность и продолжительность гомогениза-щии.
Аналогичным образом для более эффективной очистки ядер
Выделение нуклеиновых кислот из клеток растений
255-
от хлоропластов, возможно, придется модифицировать стадию 6~ В ходе
выделения целесообразно контролировать чистоту препаратов ядер под
микроскопом, окрашивая аликвоты акридиновым? оранжевым (приложение 2
[VII], В).
4.4.1.2. Обеспечение
Оборудование и расходуемые материалы
- Обычное оборудование для молекулярно-биологических исследований
(приложение III]).
- Гомогенизатор "Политрон" (Gallenkamp).
- Стеклянный гомогенизатор Поттера (Jencons).
- Высокоскоростная центрифуга с охлаждением (например,, Sorval RC-5B) с
роторами большого объема (4X250 мл|) и 'бакет-ротором (4x50 мл).
- Силиконированные и автоклавированные пробирки из корек-са (Corning).
- Стерильные центрцфужные флаконы из полипропилена объемом 250 мл.
- Стерильные кусочки бязи (20X20 ом) и нетканого материала Miracloth
(Calobiochem) для фильтрования.
- Бритвы.
- Пластмассовые чашки Петри диаметром 14 см (Sterilin).
- Автоклавированный и прокаленный стакан'из пирекса объемом 1 л.
Растворы
- Буфер для выделения ядер (1 М сахароза; 10 мМ трис-НС1,. ipH 7,2; 5
мМ MgCl2, 2 мМ 2-МЭ). На 100 мл:
Сахароза 34,2 г
