Витамины - Девятин В.А.
Скачать (прямая ссылка):
По окончании гидролиза колбу охлаждают до 40°(приблизительно) и добавляют в нее сухую пленку Penicillium notatum, взятую из расчета 0,03 г на 1 г сухого вещества навески, растирают в ступке с 5 мл ацетатного буфера и переносят в колбу, pH среды в колбе доводят ацетатом до 5,04
Колбу закрывают ватной пробкой и помещают на ночь в термостат (в темноте) при 37°.
1 Пенициллиновая пленка, в качестве источника фосфатазы, предложена Поволоцкой и Скоробогатоврй. Можно также пользоваться препаратом дрожжевой фосфатазы, описание приготовления которого см. ниже.
Содержимое колбы доводят до объема водой (до 100 мл) и фильтруют. Из фильтрата отбирают пробы на определение витамина
Для большинства образцов (дрожжи, хлебные изделия, крупа, мука) вытяжку обрабатывают в делительной воронке разными объемами изобутилового спирта, предварительно подкислив вытяжку 1 —2 каплями серной кислоты, и энергично встряхивают в течение 1—2 минут. Очень часто слой изобутилового спирта приобретает вид белой или окрашенной маслянистой суспензии, а вытяжка становится более прозрачной. Слой спирта удаляют и, если нужно, извлечение изобутанолом повторяют два-три раза, после чего из вытяжки отбирают 4 мл, помещают их в капельную воронку емкостью 25—50 мл, прибавляют 1%-ный раствор K3Fe(CN)6 в количестве 0,1—0,2 мл и 3 мл 15%-ного раствора NaOH. Количество окислителя для каждого образца должно быть предварительно подобрано отдельно. Необходимо помнить, что избыток или недостаток окислителя, добавляемого к вытяжке, ведет к частичному разрушению или недоокислению тиамина, находящегося в вытяжке. Чтобы избежать этого, ставят одновременно несколько параллельных капельных воронок с вытяжками, внося в каждую из цих разное количество окислителя, например: 0,1 мл; 0,3 мл, 0,5 мл, и прибавляют одинаково по 3 мл 15%-ного раствора NaOH. Смесь в воронке энергично встряхивают в течение полминуты и добавляют к ней 10 мл изобутилового спирта для экстракции из раствора тиамина. Встряхивают воронку после добавления спирта в течение двух минут. Смеси дают разделиться и отбирают в пробирки верхний изобутиловый слой для просмотра флуоресценции на флуорос-копе. При просмотре опытных пробирок останавливаются на той, которая при разных количествах окислителя имеет более яркую флуоресценцию, и сравнивают ее с заранее приготовленными эталонами стандартной шкалы, которая готовится из раствора тиа-минхлорида.
Если количество окислителя, которое необходимо внести в вытяжку, например 0,1 мл, известно из предыдущих опытов, то лучше приготовить отдельно смесь екислителя со щелочью: 0,3мл 1 %-ного раствора K3Fe(CN)6H 8,7мл 15 %-ного раствора NaOH, и этой смеси добавить 3 мл к вытяжке. При этом избегают возможности разрушения некоторого количества тиамина, находящегося в вытяжке, при соприкосновении с крепким раствором NaOH.
Некоторые авторы (Мурри и др.) прибавляют к вытяжке 2 мл метанола, чтобы избежать разрушения тиамина при возможно большом количестве внесенного в вытяжку окислителя. При визуальном просмотре флуоресценции на флуороскопе не приходится пользоваться бланковым опытом (без внесения в вытяжку окислителя), который служит для определения поправки на реактивы и на флуоресцирующие примеси (которые не были удалены при предварительной обработке вытяжки изобутанолом), так как эта флуоресценция бывает настолько слаба, что несравнима даже со слабым, (в ОД у) эталоном стандартной шкалы.
Приготовление стандарта и стандартной шкалы
Приготовляют 10 мг%-ный раствор тиамин-хлорида в 0,001 N 25|%-ном спиртовом растворе НС1.
Такой раствор содержит 100 у тиамина в 1 мл раствора, он устойчив в течение нескольких недель при условии хранения его в темном прохладном месте. Из него перед опытом готовят второй раствор путем разведения 1 мл основного раствора до 100 мл водой. Такой раствор готовится каждый раз при приготовлении стандартной шкалы. Он содержит 1 у тиамина в 1 мл, из него готовятся два-три нужных эталона, например 1 у; 1,5 у и 2
Для приготовления эталона, содержащего 1 у, берут 1 мл разведенного раствора тиамин-хлорида, добавляют 3 мл воды, чтобы довести общий объем жидкости до 4 мл одинаково с исследуемым образцом. Дальнейшее окисление и экстракцию проводят так, как описано выше. Для приготовления эталонов шкалы достаточно брать по 0,1 мл окислителя.
Расчет
Количество тиамина в у на 1 г анализируемого образца вычисляют по следующей формуле:
где: х—количество тиамина в у на 1 г испытуемого образца, а—исходная навеска испытуемого вещества, в г, b—количество вытяжки, взятой на просмотр флуоресценции, в мл,
с—количество тиамина в у в эталоне стандартной шкалы, соответствующее флуоресценции испытуемой вытяжки, v—объем вытяжки, в мл.
При определении интенсивности флуоресценции в флуорометре, где сила флуоресценции измеряется величиной отклонения стрелки гальванометра, смонтированного с фотоэлементом, на который падают лучи света, проходящие через флуоресцирующий раствор, результаты получаются более точные и не зависят от субъективной оценки глаза аналитика. В СССР заслуженным успехом пользуется флуо-рометр, разработанный во Всесоюзном витаминном институте Шипаловым и принятый сейчас к производству Союзвитаминпро-мом (18). Отметим также, что в ряде наших лабораторий распространен флуорометрический метод Генесси (19).
