Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
соли и др.), а также местом накопления этого вещества (в культуральной
жидкости или в клетке).
Основная задача первых этапов изучения природы фитотоксических веществ
грибов - выбор оптимального растворителя для их экстракции.
XIII.1. ВЫБОР РАСТВОРИТЕЛЯ
Для препаративного выделения и очистки фитотоксических веществ, частичной
их характеристики и идентификации используют метод сборной хроматографии
на бумаге [42, 43, 66, 297, 309]. Хроматографическую бумагу (JI 2)
нарезают полосками шириной 3 и длиной 50 см. На расстоянии 3 см от
нижнего края полоски карандашом отмечают линию старта. Вторую линию
проводят на расстоянии 25 см от линии старта. Второй линией обозначают
фронт прохождения растворителя. На линию старта микропипеткой или
медицинским шприцем (объем 1 см3) наносят фильтрат культуральной жидкости
в количестве 0,2- 0,4 мл, постоянно подсушивая бумагу теплым воздухом.
После этого полоски хроматографической бумаги помещают в
хроматографические камеры диаметром 5 и высотой 40 см. На дно цилиндров
наливают растворители слоем 2-5 см. Полоски помещают в камеры так, чтобы
их концы были опущены в растворитель на глубину 0,5 см. Набор
растворителей, используемых для хроматографии, в зависимости от целей
исследования может быть различным. Для идентификации фитотоксических
веществ грибов лучше использовать элюотропный ряд Траппе [248].
Характеристика ряда приведена в табл. 25.
Очевидно, что с уменьшением степени адсорбции в элюотропном ряду,
уменьшается растворимость воды в растворителе, а также диэлектрическая
проницаемость членов ряда. Поверхностное натяжение на границе между водой
и данным членом элюотропного ряда, наоборот, возрастает. Первые члены
элюотропного ряда - наиболее сильные элюен-
334
Таблица 25. Элюотропный ряд Траппе
Растворитель Растворимость воды в растворителе, г/100 г
Поверхностное натяжение вода - растворитель, Па Диэлектрическая
проницаемость
Вода 81,0
Метанол - - 31,2
Этанол - - 25,8
Пропиловый спирт - - 22,2
Ацетон - - 21,5
Этилацетат 3,000 0,63 6,1
Диэтиловый эфир 1,300 0,97 4,4
Хлороформ 0,100 2,77 5,2
Бензол 0,060 3,263,26 2,3
Толуол 0,040 3,60 2,3
Трихлорэтилен 0,020 - -
Четыреххлористый углерод 0,010 4,34 2,2
Циклогексан 0,010 - 2,0
Г ексан 0,007 5,01 1,88
ты. В некоторых случаях в качестве элюентов очень эффективны пиридин и
уксусная кислота (пиридин вытесняет химически связанные основания,
являясь одновременно хорошим растворителем, а уксусная кислота нарушает
хемосорбцию фенолов и органических кислот).
После прохождения растворителем отмеченного расстояния полоски бумаги
вынимают и высушивают на воздухе. Следует помнить, что разные
растворители движутся по бумаге с различной скоростью, поэтому необходимо
следить за движением каждого растворителя. Биоавтографию хроматограмм
проводят с использованием микробных и растительных тестов.
ХШ.1.1. МЕТОД РАСТИТЕЛЬНЫХ ТЕСТОВ
[42, 43, 53, 66]
Хроматограмму разрезают на полосы шириной 5 и длиной 3 см. На каждой
полосе, помещенной в отдельную кювету или чашку Петри, проращивают в
течение 18-24 ч семена кресс-салата. В зависимости от цели опыта можно
использовать семена других растений. Участки хроматограммы, содержащие
фитотоксические вещества, определяют по степени прорастания семян.
Физиологически активная зона характеризуется величиной Rf.
XIII.1.2. МЕТОД МИКРОБНЫХ ТЕСТОВ [66, 297]
В кювету размером 40 X 25 см, предварительно протертую спиртом, наливают
равномерным слоем агаризованную питательную среду, содержащую суспензию
клеток микроорганизма, чувствительного к изучаемому фитотоксическому
веществу. Для приготовления суспензии используют суточную культуру
микроорганизма, чувствительного к
335
действию фильтрата культуральной жидкости изучаемого штамма. Культуру в
пробирке заливают 6 мл стерильной воды, встряхивают и выливают в
расплавленную и охлажденную до 40-45° С питательную среду. Питательную
среду с культурой снова тщательно встряхивают и разливают тонким слоем в
предварительно приготовленную рамку. Полоски бумаги шириной 1 см отрезают
до линии фронта растворителя и раскладывают в кювету на застывший агар с
используемой культурой параллельно друг другу в определенном порядке.
Рамки с хроматограммами ставят в термостат на сутки. Через сутки на агаре
в месте скопления фитотоксических веществ появляются стерильные зоны, по
которым судят о продвижении вещества в каждом из использованных
растворителей элюотропного ряда Траппе. Затем вычисляют Rf
фитотоксического вещества. Агаровые пластинки, на которых обнаружены зоны
подавления роста тест-микробов, фотографируют в темном поле или в
поляризованном свете. На основании значений Rf для каждого растворителя
(отдельно в случае растительных и микробных тестов) строят кривые,
отражающие зависимость растворимости данного вещества от применяемой
системы растворителя. Для построения кривой на ось абсцисс наносят
обозначения растворителей, а на ось ординат - значения Rf. Эти данные
