Методы экспериментальной микологии - Билай В.И.
Скачать (прямая ссылка):
используют для выбора лучшего растворителя для последующей экстракции или
очистки веществ от примесей. Чем больше Rf, тем лучше фитотоксическое
вещество растворяется в растворителе и, следовательно, данный
растворитель наиболее пригоден для экстракции.
XIII.2. ВЫДЕЛЕНИЕ ФИТОТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Широкое распространение получили два способа выделения фитотоксических
веществ из фильтрата культуральной жидкости грибов: лиофилизация, или
упаривание в вакууме, и экстракция растворителями. Первым способом
выделяют вещества, которые растворимы в воде и других полярных
растворителях. Второй способ универсален.
XIII.2.1. ЛИОФИЛИЗАЦИЯ, ИЛИ ВАКУУМНАЯ СУШКА
[248]
Фильтрат культуральной жидкости полностью замораживают в тонком слое и
выдерживают в вакууме (0,01-2 мм рт. ст.). Благодаря быстрому испарению
воды замороженный раствор постоянно охлаждается. Удаляемые водные пары
улавливают в охлаждаемых ловушках или с помощью поглотителей. Поддержание
низких температур в процессе упаривания имеет большое значение для
сохранения нестабильных фитотоксических веществ. Поскольку работа
проводится в относительно глубоком вакууме, нет опасности окисления
нестабильных веществ кислородом воздуха. Для нестойких фитотоксических
веществ применяют также вакуумную сушку при комнатной температуре.
XIII.2.2. ЭКСТРАКЦИЯ [248, 250]
Предварительно высушенный материал загружают в сосуд (колбу, склянку) и
заливают растворителем. Чаще всего применяют воду, пст-ролейный и
диэтиловый эфир, метиловый и изопропиловый спирт, хлороформ, дихлорэтан,
бензол, четыреххлористый углерод. Настаива-
335
ют в течение нескольких часов или даже суток, после чего растворитель
сливают через бумажный фильтр и концентрируют. Однако этот способ не
всегда позволяет достичь полного извлечения. Только многократным
настаиванием в новых порциях растворителя удается перевести в раствор
практически все экстрактивные вещества. Когда требуется накопить
извлекаемое вещество в больших количествах, применяют перколяторы или
автоматические эксикаторы. Для осуществления экстрагирования разными
способами в системе жидкость - жидкость пригодна обычная делительная
воронка. Как правило, применяют коническую делительную воронку.
Делительную воронку фиксируют в железном или фарфоровом кольце,
укрепленном на штативе. Воронка закрывается стеклянной пришлифованной
пробкой. Кран делительной воронки необходимо предварительно проверить на
герметичность водой или эфиром и в случае надобности притереть. Следует
помнить, что воронку надо заполнять обеими фазами не более чем на 2/3
общего объема, чтобы обеспечить интенсивное перемешивание. Для
экстрагирования обычно используют смесь фильтрата культуральной жидкости
и растворителя, взятых в равных объемах. Последовательное экстрагирование
четырьмя одинаковыми порциями при использовании такого же количества
растворителя способствует более эффективной экстракции.
Закрыв делительную воронку пробкой, правой рукой берут горлышко с
пробкой, а левой - кран так, чтобы суженная часть конуса располагалась на
уровне ладони, а пальцами можно было бы свободно поворачивать кран. Если
держа!ь ладони на уровне корпуса делительной воронки, то раствор может
нагреться, упругость паров растворителя и давление в воронке увеличатся,
в результате чего пробка и кран могут выскочить. Делительную воронку с
фильтратом культуральной жидкости и растворителем поворачивают сливной
трубкой кверху и осторожно приоткрывают кран. После сброса избыточного
давления дают возможность жидкости, которая увлекается струей паров в
сливную трубку, стечь обратно в воронку. Закрыв кран, воронку несколько
раз встряхивают и снова открывают кран. Интенсивное встряхивание и
выравнивание давления в делительной воронке с атмосферным повторяют
несколько раз для достижения равновесия фаз. Укрепив делительную воронку
на штативе,следует дождаться разделения фаз, после чего открывают пробку.
Нижнюю фазу сливают через сливную трубку, верхнюю - через горлышко
воронки. Если нижнюю фазу , необходимо оставить в воронке, то верхнюю
можно отсосать с помощью сифона, пипетки или шприца. Перед выпуском
нижней фазы всегда нужно вынуть пробку.
Собранные экстракты подвергают концентрированию в пленочном или роторном
испарителе. Для термостабильных фитотоксических веществ отгонку
растворителей, особенно высококипящих, рекомендуется проводить в обычных
приборах для концентрирования растворов в вакууме. Вакуум следует
создавать водоструйным насосом.
XIII.3. РАЗДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФИТОТОКСИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Упариванием и экстракцией не удается выделить вещество в чистом виде.
Обычно получают смесь соединений, в лучшем случае с близкими физическими
свойствами. Для разделения смеси на индивидуальные Еещества чаще всего
применяют следующие методы:
337
1. Последовательную обработку выделенной смеси различными растворителями.
2. Распределение веществ между двумя несмешивающимися растворителями.
3. Хроматографию: а) на бумаге; б) на колонке; в) в тонком слое; г)
