Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.
Скачать (прямая ссылка):
Уже указывалось, что наклон кривых (см. рис. 9) плавления ДНК из разных источников, их растянутость вдоль оси абсцисс являются неодинаковыми. Наибольший наклон* кривых плавления отмечается для ДНК из клеток высших организмов, меньший — для бактериальной ДНК, а особенной крутизной отличаются кривые плавления вирусных ДНК. Если рассматривать изучаемые препараты ДНК как полную совокупность фрагментов генома соответствующего организма, отвлекаясь от вопроса о том, насколько деградированы ДНК при выделении, то можно считать, что крутизна кривых плавления в значительной мере отражает неравномерность распределения ГЦ-пар вдоль всей ДНК генома.
Нагревание, как уже было указано, отнюдь не является единственным агентом, денатурирующим ДНК. Подкисление до значений pH, меньших 4,0, а надежнее — до рН<3,0, или подщелачива-ние до значений pH, больших 11,0, резко повышает либо вероятность образования NH3 -групп, либо перехода кетогрупп в енольные, что нарушает водородные связи между основаниями и ведет к более или менее полному расхождению цепей. Однако обратим еще раз внимание на широту интервала значений pH, при которых бис-пиральная структура ДНК стабильна. Более того, при pH 5,5—8,5 не отмечается не только денатурации, но даже изменений температуры плавления.
Биспиральные структуры устойчивы к снижению ионной силы, но при ц, меньшем 10~*, экранирование фосфатных групп солями нарушается в такой степени, что наступает расхождение цепей.
В отличие от pH можно отметить влияние ионной силы на температуру плавления в широком интервале значений ц. Это обстоятельство используется в тех случаях, когда необходимо исследование кривых плавления ДНК при низких температурах, например в экспериментах с хроматином, содержащим ряд белковых компонентов, денатурирующихся уже при 50—60° С. Снижая ионную силу от физиологических значений до примерно 10~3, удается уменьшить Гил ДНК до 50° С и ниже.
Существует и ряд других агентов, денатурирующих нуклеиновые кислоты или, чаще, способствующих денатурации. К последним относятся многие соединения, склонные к образованию водородных связей: мочевина, гуанидин-хлорид, спирты и многие другие. Полагают, что их эффект обусловлен не прямым воздействием на межнуклеотидные Н-связи, а стабилизацией уже разъединившихся цепей. Содействуют, естественно, денатурации и агенты, модифицирующие основания так, что нарушается их способность к образованию водородных связей.
Весьма показательно сопоставление процессов денатурации двуцепочечных ДНК и биспиральных участков в одноцепочечных РНК. Во-первых, меньшая доля и неполноценность этих участков проявляются в меньшем значении Тпл и меньшей абсолютной величине гиперхромного эффекта. Во-вторых, большая внутримолекулярная гетерогенность спирализованных участков несколько «растягивает» кривую плавления вдоль оси абсцисс. В-третьих, наконец, в случае РНК могут наблюдаться соотношения между изменениями оптической плотности и вязкости, обратные тем, которые наблюдаются при плавлении ДНК. В самом деле, денатурация ДНК сопровождается снижением упругости молекул, переходом гигантских клубков или палочковидных структур к малым клубкам, что выражается в резком падении вязкости. В случае РНК небольшие спирализованные участки, чередующиеся с одноцепочечными участками, даже способствуют повышению компактности клубка при средних значениях ионной силы. Поэтому плавление РНК может приводить, наряду с гиперхромностью, не к понижению, а к повышению вязкости за счет разрыхления клубка.
Обратимся теперь к весьма плодотворному направлению сравнительного исследования тонких особенностей структуры различных ДНК, основанному на закономерностях процесса, обратного денатурации,— ренатурации.
Процесс денатурации нуклеиновых кислот оказался обратимым. Постепенное охлаждение раствора денатурированной ДНК или выдерживание его при температуре, примерно на 20° меньшей температуры плавления, позволяет полностью восстановить натив-ность молекулы. Напротив, быстрое охлаждение до низких температур (Он—20° С и ниже) фиксирует денатурированное состояние на длительное время. Скорость ренатурации тем больше, чем выше концентрация и однородность, гомогенность молекул исходной ДНК по их нуклеотидной последовательности. В растворе денатурированной абсолютно гомогенной ДНК вероятность того, что
/
столкнувшиеся полинуклеотидные цепочки окажутся комплементарными, равна 0,5. Присутствие других молекул, с иной последовательностью оснований, исключающей сплавление с цепочками первой ДНК, снижает вероятность встреч, которые заканчивались бы ренатурацией. Следовательно, быстрота ренатурации ДНК может служить мерой - ее гомогенности. Это обстоятельство послужило основой для разработки метода сравнительной оценки разнообразия нуклеотидных последовательностей в природных ДНК из разных организмов.
Предположим, что генетическая ДНК построена из цистронов (генов), каждый из которых обладает в целом уникальной нуклеотидной последовательностью. Это предположение справедливо для наиболее просто устроенных микроорганизмов — вирусов — и, с известным приближением, может быть принято для бактерий. Раздробим такую ДНК на фрагменты, размер которых близок к размеру наименьшего цистрона, но заведомо больше, чем простейшие триплетные наборы нуклеотидов, кодирующие отдельные аминокислоты, а также больше, чем минимальные характеристические наборы триплетов, кодирующие иммунологически различные фрагменты полипептидов в белках. Линейный размер последних невелик—14—17 нуклеотидных пар, а размер минимального цистрона близок к 300 нуклеотидным парам и лишь иногда несколько меньше (McCarty и др., 1957). Поэтому при дроблении ДНК, входящей в состав отдельного вириона или бактерий, на фрагменты длиной около 400 нуклеотидных пар (250—300 тысяч дальтон) можно практически исключить образование полинуклеотидов с повторяющимися в целом последовательностями Оснований и в то же время избежать образования значительной доли фрагментов, охватывающих соседние цистроны. Разнообразие же, гетерогенность образующихся после дробления фрагментов будет тем меньше, чем меньше общая длина исходной генетической ДНК. Следовательно, чем меньше суммарная длина ДНК отдельного вириона или бактерии, тем быстрее будет происходить ренатурация ее фрагментов после плавления. Britten и Kohne (1968) избрали в качестве удобной меры скорости этого процесса время, в течение которого рена-турирует половина фрагментов ДНК в растворе с концентрацией, равной единице, при указанном выше линейном размере фрагментов. Кинетика процесса ренатурации выражается при этом формулой:
