Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ашмарин И.П. -> "Молекулярная биология, избранные разделы" -> 21

Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.

Ашмарин И.П. Молекулярная биология, избранные разделы — М.: Медицина, 1974. — 360 c.
Скачать (прямая ссылка): molekulyarnayabiologiya1974.djvu
Предыдущая << 1 .. 15 16 17 18 19 20 < 21 > 22 23 24 25 26 27 .. 164 >> Следующая

последовательностей в ДНК I I I I I I I [ I I I высших организмов, с дру-
‘ 5' гой, явился феномен, от-
Л3' крытый недавно Thomas и сотр. (1970). Если большие фрагменты ДНК, CO-5, стоящие из повторяющихся участков, подвергнуть кратковременному воздействию специфических нуклеаз, например, так, чтобы с обоих концов фрагмента удалить часть нуклеотидов с З'-кон-ца, то обнажившиеся 5'-кон-цевые цепочки будут способны замыкаться друг на друга, сплавляться и давать биспираль. При этом фрагмент ДНК образует кольцо (рис. 11). Это понятно, ибо обнажающиеся цепочки должны быть, хотя бы отчасти, комплементарными, так как происходят из участков с идентичными нуклеотидными последовательностями. Размеры и среднее число колец, образующихся из ДНК, устанавливают с помощью электронного микроскопа и другими методами. В результате можно опять-таки прийти к оценкам доли повторяющихся участков ДНК различных организмов. Эти оценки очень близки к тем, которые получаются, исходя из кинетики ренатурации.
Мы рассматривали пока процессы ренатурации, так сказать, в чистом виде, когда происходит восстановление двуцепочечных структур ДНК из полностью комплементарных цепей. Если свести вместе продукты денатурации целых молекул ДНК, лишь частично совпадающих по нуклеотидным последовательностям, то в условиях ренатурации будут возникать двуцепочечные молекулы не только из гомологичных цепей, но и из цепей разных ДНК. Естественно, в последнем случае биспиральные структуры будут возникать не на всем протяжении молекул. Этот процесс часто называют молекулярной гибридизацией. Вообще говоря, термин этот
Рис. 11. Образование колец из фрагментов ДНК, содержащих участки с повторяющимися последовательностями, после обработки З'-экзонуклеазой.
Границы повторяющихся участков намечены
штрих-пунктиром.
11 1 11 11 11 :i in 1 Г j и 1 |г- 1 it'll | Г"
J
Я'
I
З'-Экзонуклеаза
ъ
неоднозначен, ибо молекулярной гибридизацией можно было бы назвать обмен биспиральными фрагментами между молекулами ДНК. Однако общепринятым является именно первое значение термина. Чем ближе по первичной структуре сводимые ДНК, чем более они гомологичны, тем будет больше протяженность спирализованных участков в гибридной молекуле. По доле последних можно количественно оценивать сходство нуклеотидных последовательностей ДНК разных организмов. Если же учесть, что последовательность нуклеотидов большей части ДНК — это и есть материализованная генетическая информация, то становится очевидным, что таким способом можно получить ценнейшие данные о степени генетической близости разных организмов и подойти к решению труднейших проблем таксономии и эволюции.
Предложен целый ряд методов количественной оценки степени гомологии разных ДНК при молекулярной гибридизации. При этом можно идти либо по пути гибридизации наиболее высокомолекулярных ДНК, измеряя далее тем или иным способом долю образовавшихся биспиральных участков, либо предварительно дробить обе или одну из сравниваемых ДНК на фрагменты, близкие по размеру к минимальным цистронам (генам), и оценивать далее, какая доля фрагментов может гибридизироваться. Принципиальные схемы процессов представлены на рис. 12. Более практичным оказался второй путь, хотя вначале внимание исследователей привлек первый. Так, четкие результаты без предварительного дробления ДНК (вариант о на рис. 12) были получены, когда одна из ДНК «утяжелялась» введением N15 (через среды выращивания данного организма), затем гибридизировалась с «легкой» ДНК из второго организма, и смесь разделялась ультрацентрифугированием в градиенте плотности Cs Cl. Гибридная ДНК, содержащая лишь одну нить с Ni5, занимала промежуточное положение между ДНК I и II, которые также частично ренатуриро-вались. Вероятность встречи полинуклеотидной цепочки из каждой ДНК с цепочкой из своей или чужой ДНК легко рассчитать. Она оказалась в удовлетворительном соответствии с действительным количественным распределением ДНК при градиентном ультрацентрифугировании между тремя пиками: тяжелой, легкой и промежуточной ДНК. Исключением были лишь случаи, когда степень гомологии ДНК I и II была столь низкой, что гибридная ДНК оказывалась крайне нестабильной, и вновь разъединившиеся цепи рано или поздно сталкивались и спирализовались с полностью гомологичной цепью из своей ДНК. Однако, даже получив выраженный пик гибридной ДНК, еще нельзя было сделать заключения о том, какова в ней доля биспиральных участков и какова количественно степень гомологии. Один из наиболее эффективных приемов, позволивших решить и эту задачу, был основан на существовании нуклеаз, расщепляющих только одноцепочечные нуклеиновые кислоты, но неспособных атаковать биспиральные участки (подробнее о нуклеазах см. гл. II). Обработка смеси продуктов ренатурации такими нуклеазами (перед ультрацентрифу-
ДНК I
(цистроны)
/\
ДНК II
(цистроны)
Предыдущая << 1 .. 15 16 17 18 19 20 < 21 > 22 23 24 25 26 27 .. 164 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed