Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Ашмарин И.П. -> "Молекулярная биология, избранные разделы" -> 22

Молекулярная биология, избранные разделы - Ашмарин И.П.

Ашмарин И.П. Молекулярная биология, избранные разделы — М.: Медицина, 1974. — 360 c.
Скачать (прямая ссылка): molekulyarnayabiologiya1974.djvu
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 164 >> Следующая

/\
А А' А А'
Б Б' Вариант а Е Е'
т
В В' Ж Ж'
т а| [А' _
Г Г' ъу ;Е' Г Г'
Гт Д' /Ж' и и'
ц
i г! г'
Дро$-
ление д
. а
Б
в.
В
>
д
Денату -рация без дробления
Вариант б
д?
Е/е ^
Дроб-
ление
V
Б/ . ОК'
В>^ччВ, и\
J-T4
Д 'и
<
хг
г\г
и
И'
Вариант в
Рис. 12. Принципиальная схема различных вариантов молекулярной гибридизации ДНК разных организмов. Одно из упрощений схемы состоит в совпадении
границ цистронов и мест разрыва при дроблении.
Другие пояснения — см, текст.
гированием в градиенте) позволяла разрушить неспирализовав-шиеся и, следовательно, некомплементарные участки в гибридных ДНК. После разделения смеси количество оставшихся биспираль-ных фрагментов могло быть измерено, что позволяло рассчитывать долю гомологичных участков. Широкое применение этого метода было ограничено прежде всего относительной малодоступностью и громоздкостью градиентного ультрацентрифугирования, а также трудностью получения гибридной ДНК при низкой степени гомологии. Тот же метод оказался более эффективным в случае предварительного дробления ДНК. Однако это не снимало технических осложнений. Поэтому наибольшее распространение получила группа методов, количественно регистрировавших молекулярную гибридизацию фрагментов либо без разделения продуктов ренатурации, либо с более практичной техникой разделения — при посредстве фиксации одной из сравниваемых ДНК. Так, количественную оценку молекулярной гибридизации предварительно раздробленных и денатурированных ДНК разных организмов можно произвести, изучая кинетику процесса с помощью тех же приемов, что были описаны выше для ренатурации гомологичных ДНК (вариант б на рис. 12).
Если сводимые ДНК совсем не гомологичны и вовсе не образуют гибридных фрагментов, то они будут ренатурироваться в смеси независимо друг от друга. Поэтому кривые зависимости С/Со от log Cot, а также показатель Coto,i является результатом простого усреднения таковых, установленных для каждой из ДНК в отдельности. Несложно также предсказать Со*о,5 для вполне гомологичных ДНК. При частичном же образовании гибридных фрагментов результирующая Со*о,5 примет значения, промежуточные по отношению к этим крайним вариантам.
Степень гомологии сравниваемых ДНК можно при этом оценить по формуле:
где R — степень гомологии в процентах; СоА>,5100 — величина, ожидаемая, исходя из предположения о полной гомологии; С<^о,5° — величина, ожидаемая в случае отсутствия какой-либо гомологии, a Coto,s — значение, найденное в опыте (Seidler, Mandel, 1971).
Изложенный способ оценки гомологии является прямым следствием углубленного изучения кинетики ренатурации и технически не очень сложен. Однако по чувствительности, а также по применимости для оценки гомологии не только между ДНК, но и между ДНК и РНК, он значительно уступает наиболее распространенным и апробированным методам другого типа, основанным на измерении количества гибридизировавшейся нуклеиновой кислоты по радиоактивности. При этом одна из взаимодействующих нуклеиновых кислот фиксируется либо в агар-агаре, либо на целлюлозном фильтре. Ее не дробят, а лишь подвергают денатурации. Полину-клеотидная цепочка с молекулярным весом несколько миллионов
100

и более неспособна диффундировать из агарового геля (ее вводят в гель, смешивая денатурированную ДНК с расплавленным агаром, и затем охлаждают) и полностью задерживается целлюлозными фильтрами специальных марок. В таких условиях исключена ренатурация этой ДНК, ибо в результате отсутствия диффузии невозможны столкновения нитей. Напротив, вторая из сравниваемых ДНК не только денатурируется, но и дробится с таким расчетом, чтобы ее фрагменты могли свободно диффундировать в агаровом геле или переходить через целлюлозный фильтр и, встречаясь с комплементарными им участками на фиксированной ДНК первого организма, гибридизироваться с ней.
Возникающая ситуация соответствует варианту в на рис. 12. Молекулярный вес фрагментов второй ДНК измеряется сотнями тысяч. В то же время суммарные молекулярные веса ДНК геномов обоих сравниваемых организмов обычно измеряются многими миллионами. Поэтому, оценив, какое количество второй ДНК прочно связалось с первой, легко рассчитать долю гомологичных нуклеотидных последовательностей. Вторую ДНК метят путем синтеза из радиоактивных предшественников (in vivo или in vitro). Реакцию проводят в условиях, оптимальных для ренатурации (около 70°С). Негибридизировавшиеся фрагменты отмываются, и измеряется радиоактивность связанной ДНК- Методы этого типа, первый из которых был описан Bolton и McCarthy в 1962 г., послужили основой большой серии исследований в области эволюционной биохимии, суммированных далее в главе V. Этот же метод был использован не только для оценки гомологии ДНК, но также — ДНК с РНК, что необходимо для тонких исследований спектра РНК, синтезируемых на хроматине различных живых существ и тканей одного организма. Принципиальная схема остается в этом случае той же. Главное же отличие состоит в несколько меньшей температуре гибридизации (ближе к 60°С).
Предыдущая << 1 .. 16 17 18 19 20 21 < 22 > 23 24 25 26 27 28 .. 164 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed