Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Изоферментам ЛДГ присущи разные кинетические характеристики, величины pH, при которых они проявляют максимальную активность, сродство к субстратам и кофакторам. Для определения относительного содержания изоферментов используют ряд физико-химических методов: электрофорез, ионообменную хроматографию, различия в кинетических параметрах отдельных изоферментов, дифференцированную чувствительность к субстратам и ингибиторам, иммунохимические методы.
Полипептидная цепь обеих субъединиц содержит 330 аминокислотных остатков; различия в их последовательности в субъединицах обнаружены на протяжении более чем 25 % длины по-липептидной цепи.
В субъединицах фермента выделяют два домена: каталитический и центр связывания кофермента. Аминокислоты, образующие NAD'''-связывающий домен, расположены в середине молекулы ЛДГ. Структура названного домена состоит из шести складчатых слоев ((ЗА—(3F), соединенных между собой а-спиралями.
Лактатдегидрогеназа связывает лактат или пируват только в присутствии кофермента, причем первым связывается кофер-мент. NAD+ (NADH) находятся в гидрофобной полости в изогнутой конформации молекулы ЛДГ.
В каталитическом центре ЛДГ находятся полярные группы, участвующие в связывании кофермента и субстратов и катализе: остатки Arg 109, Arg 171, Arg 101, Glu 102, Asn 140, а также существенный остаток His 195, способный играть роль донора-акцептора Н+ в ходе реакции. Кроме того, для проявления активности фермента необходима сульфгидрильная группа, одна на субъединицу.
Оптимум pH для реакции восстановления пирувата в лактат — 6,5—7,5, а для обратной реакции — 8,5—9,0. Ингибируют фермент высокие концентрации NAD, фторпируват (необратимо), а-меркаптокислоты (конкурентно по отношению к лактату), сульфгидрильные реагенты. В последнем случае ингибирование предотвращается коферментом и снимается цистином и глута-тионом.
Получены сведения о взаимодействии ЛДГ со структурными белками мышц и миофибриллами, субклеточными частицами, искусственными подложками, микросомами и мембранами сар-коплазматического ретикулума.
Установлено, что взаимодействие ЛДГ с F-актином и нативным тонким филаментом приводит к уменьшению каталитической активности фермента. При связывании с F-актином происходит увеличение значения константы Михаэлиса для NADH и уменьшение максимальной скорости реакции. Для свободной и связанной форм ЛДГ выполняется уравнение Михаэлиса — Мен-тен. Предполагают, что обратимое взаимодействие изофермента М4 ЛДГ с F-актином является специфическим и обусловлено образованием белок-белкового комплекса.
Исследование кинетических параметров ЛДГ в растворе и в суспензии гомогената субклеточных частиц скелетных мышц цыпленка позволило выявить, что изофермент ЛДГ Н4 не связывается субклеточными частицами, ЛДГ М2 полностью и ЛДГ Н2М2
частично находятся в связанном состоянии. Связывание изоферментов М4 и Н2Ма приводит к значительному снижению величины максимальной скорости реакции, а также константы Ми-хаэлиса для пирувата.
При взаимодействии ЛДГ с митохондриальной фракцией и митохондриальным ингибитором из скелетных мышц кролика отмечено снижение активности фермента. Причем зависимость скорости реакции от концентрации субстратов для связанной ЛДГ была негиперболической, а зависимость 1/v от 1/[пируват]1/2 или l/[NADH]3/2 была линейной.
Описано связывание ЛДГ М4 с искусственными подложками, карбоксиметилцеллюлозой и декстрансульфатом. Взаимодействие ЛДГ из мышц свиньи с декстрансульфатом приводит к появлению положительной кооперативности по концентрации NADH, не характерной для фермента в растворе.
В. И. Лущак (1991) изучил физико-химические свойства ЛДГ, связанной с микросомальными мембранами из белых мышц шиповатого ската. Исследование кинетических характеристик для мембраносвязанного и изолированного ферментов показало, что константа Михаэлиса для данных форм (состояний) ЛДГ практически одинакова. В то же время данный показатель для NADH у связанного фермента в 4 раза ниже, чем у изолированного. Цитозольная форма ЛДГ из белых мышц шиповатого ската ингибируется наполовину при концентрации пирувата 14 ммоль/л, а связанная проявляет в этих условиях полную активность. Связанная ЛДГ обладает более высокой стабильностью, чем свободная: перевод фермента в раствор в 2,5—3,0 раза ускоряет процесс его инактивации трипсином. Такие факторы, как pH, ионная сила, субстраты и коферменты, влияют на процесс экстракции ЛДГ из микросом. При щелочных значениях pH удается солюбилизировать 48 % активности фермента, но не менее 20 % ЛДГ остается в мембраносвязанном виде. Степень экстрагируе-мости фермента из микросом возрастает по мере увеличения ионной силы раствора. При нейтральных значениях pH среды NADH экстрагирует 68 % ЛДГ. По-видимому, с микросомами из белых мышц шиповатого ската связано два пула ЛДГ. Фермент одного пула взаимодействует с мембраной за счет электростатических сил, фермент другого пула — за счет гидрофобных взаимодействий. Наличие двух пулов ЛДГ приводит к дополнительной возможности регуляции свойств фермента путем его пере-
