Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
+0,
-
кг
..........““^AUo
+А 2
Kq з
......................v3Oo + Q
+Q ->qo2
где G — источник, генерирующий Ю2; kd — константа дезактивации Ю2 растворителем; kr — константа скорости реакции Ю2 с акцептором (окисляемым веществом); к — константа скорости тушения (или химического взаимодействия) с потенциальным протектором.
В присутствии двух конкурирующих за Ю2 соединений (А и Q) квантовый выход окисления акцептора определяется по уравнению
1
Фао, Ф><
1 +
kd + kq [Q] kr [а]
л
Реакционная способность органического соединения и тушителя характеризуется параметрами: (Зд = kd /кг и Pq = k<j /kq . Эффективная защита молекулы от повреждающего действия Ю2 в присутствии тушителя возможна при соблюдении условия
kq[Q]»kd + kr [А]. Следовательно,
[Q]»Y4 + tjl[a] и [q]»Pq + -—[a]
kq kq v kq
Время жизни l02 в H20 составляет 3,1+3,2 мкс, значит, к,= 1/х = (3,2+3,1)-105 с-1. Если принять к для азида натрия — 2’108-f-2'109 л-(моль-с)"1, кг (ЛДГ) — 109+101“ л-(моль-с)"1, то получаем:
P(NaN3)=l, 6• 10_3(_4),
1 Г)9(10)
[NaN, ]»1,6 • 1 <ГЗМ> + ¦ [ЛДГ].
Величина второго слагаемого в правой части неравенства будет пренебрижимо мала по сравнению с первым до значений концентраций фермента ~10“6 моль/л. Следовательно, в этом случае
90
80
70
60
50
Ai 100 90 80
А2 70 60 50
Ai 100 90 80
А2 70 60 50
Аг
Рис. 54. Изменение фото чувствительности ЛДГ в присутствии азида натрия (а), (3-каротина и D-маннита (б), гистидина (в). По оси абсцисс — концентрации модификаторов, моль/л; по оси ординат — ферментативная активность, %. Аг — активность нативного фермента, А2 — УФ-облу-ченного фермента. Концентрации модификаторов: а) / — 6,640~б моль/л;
2 — 6,6-10~4 моль/л; 3 — 3,2*10“3 моль/л; б) 1 — 3,3-10"5 моль/л ((3-каротин); 2 — 5,5-10-5 моль/л (D-маннит); 3 — (3-каротин + D-маннит; в) 1 — 1,3-10"3 моль/л; 2 — 1,3-10“2 моль/л; 3 — 3,3*10~2 моль/л
концентрация азида натрия для проявления фотопротекторного эффекта должна превышать 1,6*10-3(_4) моль/л.
Эти теоретические расчеты были подтверждены результатами экспериментов по изучению УФ-чувствительности (доза облучения — 2,27 кДж/м2) изофермента М4 ЛДГ (2*10~8 моль/л) в присутствии азида натрия в концентрациях 6,6-10-5; 6,6-10-4;
3,2-10_3 моль/л (рис. 54,а). Из анализа рисунка следует, что NaN3 в концентрации 3,2*10-3 моль/л практически полностью восстанавливает ферментативную активность исследуемого белка. При изучении спектрально-люминесцентных характеристик ЛДГ (10_б моль/л) после ее облучения в свободном состоянии и в присутствии азида натрия (3,2*10_3 моль/л) выявлено, что воздействие УФ-света на смесь фермент-азид натрия приводит к восстановлению до уровня контрольного образца величин интенсивности люминесценции модифицированного белка в его максимуме (340 нм) и светопоглощения в минимуме (250 нм) и в более длинноволновой области (>290 нм), что связано, вероятно, с защитой хромофорных групп ЛДГ от действия УФ-излучения.
На рис. 55, а показаны кривые зависимости остаточной ферментативной активности мышечной изоформы ЛДГ от времени облучения. Для количественного описания данного процес-
Рис. 55. Кинетические кривые фотоинактивации лактатдегидрогеназы из мышц (а) и сердца {б) свиньи в присутствии некоторых фотопротекторов: a) I — нативная ЛДГ; ЛДГ, УФ-облученная в присутствии модификаторов: 2 — азида натрия (3,2-10's моль/л); 3 — D-маннита (5,5-10"5 моль/л); 4 — серотонина (1*10-5 моль/л); б) 1 — нативная ЛДГ; 2 — ЛДГ, УФ-облученная в присутствии азида натрия (3,2*10~8 моль/л)
са мы использовали константы фотоинактивации (kf), рассчитанные по тангенсу угла наклона линейной анаморфозы исходной кривой «доза — эффект» в координатах [ln(A/A0); t]. Для нативной ЛДГ kf оказалась равной 5,39*10~4 с'1. Экспоненциальный характер кривой фотоинактивации свидетельствует об отсутствии процессов реактивации УФ-модифицированного белка и позволяет отнести последовательность фотохимических реакций ЛДГ к категории мономолекулярных реакций первого порядка. Время полупревращения ЛДГ (период, в течение которого каталитическая активность белка уменьшается на 50 %) в этом случае составит: t = In 2/k = 0,693/k = 1286 с = 21 мин. При концентрации фермента 0,2*10~8 моль/л («преддиссоциационной») форма кинетической кривой фотоинактивации не изменяется, однако kf существенно увеличивается и становится равной 3,05-Ю"3 с"1, а t1/2 = 227,2 с = 3,8 мин. Следовательно', УФ-чувствительность ЛДГ возрастает при разведении ее растворов.
Добавление азида натрия (3,2*10~3 моль/л) при облучении раствора изоформы М4 ЛДГ (2-10~8 эдоль/л) вызывает частичное восстановление каталитической активности фермента. Однако
дозовая зависимость описывается прямой, а в полулогарифмических координатах — квадратичной функцией (см. рис.55, а). Это свидетельствует о постоянстве скорости инактивации ЛДГ в изучаемом диапазоне. Таким образом, протекторный эффект NaN3 на разных стадиях фотомодификации фермента неодинаков. Защитное действие азида натрия может быть обусловлено тушением а также его комплексированием с белковой макромолекулой и, возможно, образованием внутримолекулярных сшивок некоторых функциональных групп ЛДГ, что индуцирует повышение фоторезистентности зафиксированной конформации биополимера. Не исключено также тушение азидом натрия возбужденных состояний белка и его взаимодействие со свободными радикалами, образующимися в процессе УФ-модификации молекул фермента.
