Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами - Артюхов В.Г.
ISBN 5-7455-1162-1
Скачать (прямая ссылка):
Существенную роль в процессах темнового и фотоокисления биологических структур играют синглетный кислород и радикал гидроксила, обладающие наибольшим модифицирующим эффектом. Одним из широко используемых методов исследования роли тех или иных активных интермедиатов в процессе УФ-мо-дификации белка является элиминирование их при помощи специфических акцепторов и тушителей.
Рассмотрим более подробно результаты исследования фото-индуцированных изменений структурно-функциональных свойств изоферментов лактатдегидрогеназы из различных источников в интактном состоянии и в присутствии ряда химических соединений, способных взаимодействовать с активными формами кислорода.
Каталитическая активность растворов изофермента М4 ЛДГ (0,2‘10~8 моль/л) из скелетных мыщц свиньи при действии УФ-света (240—390 нм) в дозах 0,15—4,53 кДж/м2 снижается с ростом дозы облучения (В. Г. Артюхов и соавт., 1997, В. Г. Артю-
* Раздел написан с участием Ю. А. Лысенко и Н. В. Агишевой.
хов, М. А. Наквасина, 1991). NADH (2,4-10~7 моль/л) оказывает фотосенсибилизирующее действие по отношению к молекулам фермента при УФ-облучении их смеси. Падение каталитической активности ЛДГ происходит под влиянием УФ-излучения, поглощаемого как апоферментом (Я- < 280 нм), так и коферментом (Х> 260 нм). По-видимому, в процесс фотоинактивации ЛДГ вносят вклад преимущественно фотохимические превращения апо-белка, связанные с поглощением энергии УФ-света остатками ароматических (триптофана, тирозина — входит в активный центр ЛДГ, фенилаланина) и серосодержащих аминокислот белка. Присутствие указанных аминокислотных остатков в молекуле мышечной изоформы фермента было продемонстрировано при исследовании ее аминокислотного состава (табл. 14).
Таблица 14 Содержание отдельных аминокислот в молекуле лактатдегидрогеназы
Аминокислоты Количество, % на Аминокислоты Количество, % на
100 г белка 100 г белка
Asp 7,820 Met 3,693
Thr 4,260 lie 4,819
Ser 3,294 Leu 10,579
Glu 9,640 Туг 3,793
Pro 6,273 Phe 4,078
Gly 4,006 His 2,937
Ala 4,092 Trp 2,068
"Полуцистин" 1,141 Lys 9,610
Val 8,626 Arg 6,388
Наблюдаемые при воздействии УФ-света нарушения структурного состояния и функциональной *активности ЛДГ являются результатом разворачивания белковой глобулы, что находит отражение в изменении оптических и гель-хроматографических свойств УФ-облученного фермента.
Продуктом фотодеградации остатков триптофана являются кинуренины и формилкинуренины. Показано, что производные триптофана способны выполнять функцию фотодина-мических сенсибилизаторов, в частности, генерировать синг-летный кислород. В качестве источника Ю2 рассматривают процессы тушения кислородом триплетных состояний ароматических или карбонильных соединений, которые входят в
состав макромолекул или присутствуют в них в виде примесей. На потенциальную возможность генерации Ю2 в реакции триплетных возбужденных состояний белков указывает И. И. Сапежинский (1979). Образование синглетного кислорода может происходить в короткоживущих комплексах с переносом заряда: ароматический углеводород (аминокислотный остаток) — кислород.
С целью получения дополнительной информации о механизме фотопревращений ЛДГ необходимо исследовать УФ-индуци-роваиные изменения структурно-функциональных свойств и кинетики фотоинактивации различных изоферментов ЛДГ в широком спектральном диапазоне УФ-излучения для выяснения возможного участия модифицированных триптофаиилов в качестве «внутримолекулярных аутосеисибилизаторов». Для изучения роли активных кислородных метаболитов в процессах УФ-превращений белка используют их специфические акцепторы и тушители: азид натрия, D-маннит, {3-каротин, гистидин, серотонин. Применяемые концентрации вышеназванных соединений не должны оказывать заметного влияния на уровень активности нативного фермента.
Распространенным тушителем синглетного кислорода является азид натрия, защитное действие которого было продемонстрировано по отношению к сенсибилизированному окислению различных органических субстратов. Константа скорости его реакции с Ю2 — 2-108 л^моль-с)-1, 2-109 л-(моль’с)”1. Азид натрия тушит триплетные состояния возбужденных молекул, но константа скорости данной реакции в последнем случае на 2 порядка ниже. Для подбора концентрации NaN3 можно использовать предположение о простом конкурентном перехвате синглетного кислорода в исследуемой модельной системе и в соответствии с известными-константами скорости взаимодействия Ю2 с компонентами этой системы. Для ЛДГ такая константа не определена, но в первом приближении можно принять ее значения равными 109— 1010 л-(моль'с)-1 (И. И. Сапежинский, 1988). Суммируя известные литературные данные (Б. Рэнби, Я. Рабек, 1978, В. Я. Шляпин-тох, 1979, X. Фут, 1979, Н. А. Шинкаренко, В. Б. Алесковский, 1981, Ю. А. Владимиров, А. Я. Потапенко, 1989), взаимодействие синглетного кислорода с возможными субстратами реакции может быть представлено с помощью следующей упрощенной формально-кинетической схемы:
