Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
Метод нуклеотидных карт, в случае его применения для ана* лиза смеси фрагментов, образуемых исследуемой рестриктазой
при расщеплении субстрата, позволяет выявить гомологичные концевые их участки. Границы его применения во многом определяются структурой участка, узнаваемого исследуемым ферментом, местом расщепления субстрата и его природой. В последнем случае имеется в виду тот факт, что при использовании линейного субстрата, имеющего небольшое число участков, узнаваемых исследуемым ферментом, его концевые последовательности (негомологичные с сайтом рестриктазы) проявляются на фингерпринте. Это может затруднить однозначную интерпретацию получаемых результатов.
Обсуждаемый метод наиболее эффективен в самых простых случаях проявления специфичности рестриктаз, т. е. когда фермент узнает палиндромную последовательность нуклеотидов и разрыв фосфодиэфирных связей производит в ее пределах. Он успешно используется и в тех случаях, когда в узнаваемом участке наблюдается вырожденность. Рестриктазы Sau96 I [202], Sin I [167], Aos II [85], Fdi I [280] и Асу I [84], узнающие такие последовательности, были охарактеризованы с использованием метода нуклеотидных карт. Однако в общем случае он малопригоден для определения структуры более вырожденных узнаваемых участков. В этих случаях, а также когда расщепление происходит за пределами субстратного участка, задача определения его структуры, а также места разрыва, осложняется. Однако это не исключает возможности применения обсуждаемого метода с этой целью. В таких случаях анализу подвергаются выделенные индивидуальные ДНК-рестрикты, содержащие метку только в одном из концов анализируемого фрагмента. Такой прием был использован в опытах по определению субстратной специфичности рестриктазы NspB II [91], узнающей 5'-С(А/С)GC (T/G)G последовательность.
Достоинством метода фингерпринтирования является то, что для его применения не обязательно иметь сведения о сайтовой •специфичности исследуемых рестриктаз.
Методы секвенирования ДНК. Среди приемов, которые успешно применяются при исследовании специфичности рестриктаз, следует отметить метод секвенирования ДНК. Одной из первых рестриктаз, для определения места расщепления которой был применен этот подход, следует считать рестриктазу Pst I [63]. Тогда был использован так называемый «плюс — минус» метод, разработанный Сенгером и Каулсоном [230]. Стратегия его применения в отношении определения места расщепления рестриктаз была разработана Брауном и Смитом [63]. В методичном плане она относительно громоздка и подробно изложена в пособии «Методах энзимологии» [65], а также в «Итогах науки и техники» [7], поэтому здесь рассмотрим лишь основные этапы этого подхода. В основе самого метода секвенирования заложена стратегия, позволяющая получить меченые продукты матричного копирования исследуемого ДНК-фрагмен-
та в лимитирующих условиях (плюс — минус реакции). В результате получается иабор реакционных смесей в каждом из которых реакция копирования статистически завершалась у какого то определенного нуклеотида. Разделение этих реакционных смесей в параллельных дорожках высокоразрешающего электрофореза в полиакриламидном геле позволяет получить так называемую «структурную лесенку», из которой по наличию или отсутствию радиоактивного фрагмента определенной длины в каждой из дорожек можно определить первичную последовательность исследуемого фрагмента. В экспериментах по определению места расщепления по результатам картирования подбирается фрагмент ДНК, содержащий участок разрываемый исследуемой рестриктазой, и устанавливается его первичная структура. Для определения места расщепления субстрата используются две дополнительные пробы, содержащие набор продуктов лимитированого копирования матрицы. Обе пробы подвергаются полной достройке матрицы и затем расщепляются исследуемой рестриктазой. Затем в одну из проб добавляют ДНК полимеразу Т4 и все четыре предшественника дезоксинук-леотидов. Пробы анализируют параллельно с продуктами «плюс — минус» реакций и по положению продукта из первой пробы определяют место расщепления меченой цепи. Во второй пробе, в зависимости от типа построения концов рестриктов, полимераза благодаря присущей ей 3'-----------»-5'-экзонуклеазной
и 5'---*-3' полимеразной активностям или достраивает меченую
цепь (в случае Б'-выступающих концов) или ее укорачивает (в случае З'-выступающих концов). Таким образом по изменению подвижности продукта второй пробы определяется место расщепления комплементарной цепи. Совпадение подвижности продуктов обеих проб будет означать, что рестриктаза расщепляет субстрат с образованием полностью спареных концов. С использованием метода секвенирования в вышеизложеном варианте была определена специфичность расщепления субстрата для рестриктаз Mbo II (5'GAAGA) [61], Hga I (5'GACGC), [64], Taq I (5'TCGA) [235].
Следует отметить, что «плюс — минус» метод в настоящее время утратил свое значение и уступил свои позиции более простым и эффективным методам секвенирования. Как естественное продолжение его развития был разработан метод «терминирующих аналогов трифосфатов» (метод Сенгера) [233]. Другой метод секвенирования, основывающийся на химической модификации ДНК, был разработан, в основном, благодаря усилиям Максама и Гильберта [176]. Оба эти метода незамедлительно стали применяться и для изучения специфичности рестриктаз. Принципиально они отличаются только способами получения статистического набора меченых фрагментов, последующее разделение которых в полиакриламидном геле в конечном итоге приводит к «структурной лесенке». Стратегия опреде-
