Биотехнология. Том 17 - Янулайтис А.А.
Скачать (прямая ссылка):
20. SaIG I --- 0.15 --- 105 0.8 177]
21. Taq I 2.4 26 10 833 --- 43 34]
20. Xho I 600 0.5 0.83 --- --- 15]
а — данные о степени очистки и выходе рассчитаны, начиная с первой стадии выделения.
(—) — сведения отсутствуют
с мнением Кларк и Гартлея [74], что был получен не гомогенный препарат рестриктазы Bst 1503, а препарат какого-то другого белка, содержащего примесь исследуемого фермента. Поэтому в сводной таблице содержатся только данные об очистке Bstl503, полученные последними авторами.
Как следует из данных, представленных в табл. 22, относительные выходы, рассматриваемые для тех случаев, когда оказалось возможным их рассчитать начиная с определения содер-
жания целевого фермента в грубых экстрактах, находятся в интервале 10% (EcoR II) —32% (Mva I). Такой в общем большой выход рестриктаз, учитывая необходимую для достижения их гомогенности многократность очистки (см. табл. 22), свидетельствует об эффективности разработанных схем.
Обращает на себя внимание тот факт, что масштабность процессов выделения рестриктаз (за исключением Bst I) является небольшой, а количество получаемых в конечном счете препаратов измеряется несколькими миллиграммами или даже долями миллиграммов.
Учитывая высокую чувствительность современных аналитических методов, используемых для изучения структурно-функциональных особенностей этих ферментов и механизмов их взаимодействия с ДНК, этих количеств достаточно для проведения таких опытов.
Количественных данных о содержании целевых ферментов при пересчете на гомогенный белок в биомассе продуцентов рестриктаз мало [13, 29, 58, 138, 140, 152, 196, 254]. В исследованных немногочисленных случаях эти значения приблизительно равны (мкг/г сырой биомассы продуцента): 6 — Bsu I [58], 44 — Bsp I [283], 45 — Mva I [29] и 68 — Ben I [196]. По этому показателю их превосходит только EcoR II, Hha II, PaeR7, EcoR V и Taq I. Сверхсинтез этих ферментов был достигнут благодаря успешному применению для конструирования продуцента методов генной инженерии [13, 34, 80, 140, 154, 272].
Высокая продуктивность штамма по отношению к целевому белку является важной предпосылкой для его получения в гомогенном состоянии. Однако, для ее реализации необходимо создать эффективную схему очистки. С учетом данных об абсолютных выходах рестриктаз (мкг/г биомассы), приведенных в табл. 22, можно рассчитать, что для получения 1 мг гомогенной Pal I (самый низкий выход — 0,52 мкг/г биомассы) необходимо было бы обрабатывать около 2 кг биомассы соответствующих продуцентов. Для получения по 1 мг большинства остальных, перечисленных в табл. 22 рестриктаз, понадобилось бы вести выделение из нескольких сотен грамм биомассы. Исключениями являются рестриктазы EcoR V, PaeR7 I и Taq I, выделяемые из генноинженерных продуцентов в количествах 3, 0,29 и 10,8 мг/г биомассы соответственно. Учитывая вышесказанное, использование в опытах по выделению гомогенных препаратов рестриктаз не столь уж и больших объемов биомассы, равняющихся десяткам [29, 58, 152, 196], сотням [13, 15, 33, 118, 127, 163, 254, 299, 302] граммов и реже одному — нескольким килограммам [15, 74, 138, 184, 228], позволяет получать необходимые количества целевых ферментов. Тем не менее, в подавляющем большинстве случаев эти объемы биомассы превышают на порядок таковые, обрабатываемые в ходе выделения функционально очищенных препаратов рестриктаз. Эти
различия находят отражение и в методических подходах, направленных на создание схем выделения гомогенных препаратов рестриктаз и их реализацию.
Кроме масштабности определенный вклад в специфику этих схем вносит необходимость достижения физической чистоты белка, что a priori является более сложной задачей, чем очистка от функциональных нежелательных примесей. Указанные факторы находят выражение в схемах выделения гомогенных рестриктаз как в отношении способов осуществления отдельных стадий, так и их количества и качественного набора.
В препаративных опытах для разрушения клеток наряду с ультразвуком [29, 80, 106, 127, 152, 234, 299] относительно часто используются механические экструзионные дезинтеграторы [13, 74, 138, 163, 184, 254], позволяющие обрабатывать большие объемы биомассы. Получаемые объемы гомогената в большинстве случаев не исключают возможности проведения стадии центрифугирования в режимах, аналогичных таковым в случае аналитических опытов. Только в случае выделения Bstl 503, проводившегося из 70 кг биомассы В. stereother mophilus 1503, с этой целью было использовано проточное центрифугирование [74].
Увеличение объемов рабочих растворов находит отражение и в методических приемах, используемых на стадии удаления нуклеиновых кислот. Гельфильтрация, довольно часто применяемая в опытах по получению функционально очищенных препаратов рестриктаз, в масштабированных схемах очистки практически не встречается. Единственное исключение в этом плане составляет первоначальная схема выделения гомогенной рестриктазы Bsp I [152]. Однако, в ходе усовершенствования схемы очистки этого фермента, этот прием был заменен на высажде-ние нуклеиновых кислот полиэтиленимином [283]. Отказ от применения гельфильтрации в обсуждаемых опытах следует отнести не только за счет малопривлекательности масштабирования этой процедуры, но и за счет низкой ее эффективности на первой стадии в отношении очистки целевых ферментов.
